Sindromi linfoproliferative croniche Caratteristiche comuni Espansione della malattia più per accumulo che per attiva replicazione. Cellule arrestate in fase G0 del ciclo cellulare per meccanismo di inibizione dell’apoptosi. Decorso spesso indolente. Difficile eradicazione. Possibilità di trasformazione verso una forma più aggressiva.

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LEUCEMIE CRONICHE B-LLC B-PLL HCL T-LGL NK-LGL LINFOMI LEUCEMIZZATI FOLLICOLARI MANTELLARI DELLA ZONA MARGINALE

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE Linfocitosi in presenza o meno di linfoadenomegalie, epato-splenomegalia; sviluppo di anemia, piastrinopenia, ipogamma-globulinemia, sintomi sistemici Oggi diagnosi spesso occasionale nel 70-80% dei casi Diagnosi definitiva basata sulla combinazione di linfocitosi con morfologia e immunofenotipo caratterisitci

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LINFOCITOSI LINFOADENOMEGALIA

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA ASPETTI DIAGNOSTICI LINFOCITOSI ASSOLUTA Il valore assoluto dei linfociti è > 5000/ml RELATIVA % dei linfociti è superiore a quella dei neutrofili

REATTIVA O NEOPLASTICA? ASPETTI DIAGNOSTICI LINFOCITOSI REATTIVA O NEOPLASTICA? (quantità+qualità)

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA Linfocitosi>5x109L Le linfocitosi benigne o “reattive” sono espansioni di linfociti T e B policlonali. I disordini linfoproliferativi maligni sono caratterizzati da una proliferazione di linfociti B o T monoclonali.

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: DIAGNOSI Morfologia Citochimica Immunofenotipo Citogenetica Genetica molecolare Profilo genomico

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE DIAGNOSI MORFOLOGIA + IMMUNOFENOTIPO

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Leucemia Linfatica Cronica Tipica Mista

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Linfoma Follicolare

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Linfoma Mantellare

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Linfoma splenico a linfociti villosi

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Leucemia a prolinfociti

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO Definizione diagnostica Identificazione di fattori prognostici Identificazione di sottotipi a diversa prognosi Identificazione della malattia minima residua

+ Accessibilità delle cellule neoplastiche Disponibilità di AcMo MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO Accessibilità delle cellule neoplastiche + Disponibilità di AcMo “Stabilità fenotipica” IDENTIFICAZIONE DI PATTERN CARATTERISTICI

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO ANTIGENI LEUCOCITARI E NOMENCLATURA CD ANTICORPI MONOCLONALI CONTRO ANTIGENI LEUCOCITARI RAGGRUPPATI IN BASE ALLA REATTIVITA’ CON MOLECOLE IDENTICHE MARKERS DI PRECUSORI: CD90,CD133,CD34 MARKERS DI LINFOCIT B: CD19, CD20, CD79,CD10 MARKERS DI LINFOCITI T: CD2. D7, CD3, CD4 , CD8 MARKERS DI CELLULE NK: CD7, CD56, CD57, CD158 MARKERS NON RISTRETTI A UNA LINEA DI DIFFERENZIAZIONE: CD11b, CD11c, CD25, CD38, CD27

IMMUNOFENOTIPO Identificazione di una popolazione cellulare un tessuto (biopsia) una sospensione (aspirato midollare, linfonodo, sangue periferico, liquor,versamenti biologici) Caratterizzazione di una popolazione cellulare linea di appartenenza stadio di differenziazione asincronia di maturazione presenza di aberrazioni

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO Possibilita’ di studiare sangue intero (periferico e/o midollo) Sviluppo di strategie di analisi multiparametriche per meglio identificare la popolazione da analizzare Possibilita’ di impiegare reagenti e tecniche di permeabilizzazione della cellula Sviluppo di tecniche per la quantificazione dell’espressione antigenica

APPROCCIO MULTIPARAMETRICO (FSCvsSSC, FSCvsFL, SSCvsFL, FLvsFL) MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO METODI DI ANALISI APPROCCIO MULTIPARAMETRICO (FSCvsSSC, FSCvsFL, SSCvsFL, FLvsFL) DETERMINAZIONE QUANTITATIVA (% cellule positive) DETERMINAZIONE QUALITATIVA (MESF, MFI)

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO NON PUO’ PRESCINDERE DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE

NORMALE LLC LNH NORMALE HC LNH

FREQUENZA RELATIVE DELLE DIVERSE POPOLAZIONI NEL SANGUE PERIFERICO E NEI TESSUTI LINFOIDI (%) LN TONSILLE MILZA INFANZIA ADULTO 2-5aa 5-15aa B-LIN 24 17 12 41 51 55 CD3+ 64 68 72 56 49 31 CD4+ 37 38 44 48 42 CD8+ 26 10 6 14 NK 13 1 <1 15

NEOPLASIE EMATOLOGICHE METODI DI ANALISI APPROCCIO MULTIPARAMETRICO R1 R2 R3 R4 R5

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE B-LLC B-PLL HCL MCL FL SLVL SmIg ± +++ ++ CD19 CD5 + - CD20 CD23 CD11c FMC7 CD25

NORMAL PERIPHERAL AND BONE MARROW B CELL SUBSETS: % OF B CELLS

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE I marcatori espressi dal linfocito B neoplastico sono molteplici e “l’importanza” di ciascuno di essi è diversa. Tuttavia, la diagnosi immunofenotipica di malattia linfoproliferativa cronica B può essere posta solo in presenza di restrizione clonale k o l delle catene leggere delle immunoglobuline !!!!!!!

LINFOCITOSI B MONOCLONALI MLUS O CLUS NEL SANGUE PERIFERICO<5X109/L KAPPA:LAMBDA >3:1 O <0.3:1 25% DELLE CELLULE NON ESPRIMONO O ESPRMONO A BASSA INTENSITA’ sIG IMMUNOFENTOTIPO SOVRAPPONIBILE A QUELLO DELLE PIU’ COMUNI SLC (CD5+/CD23+; CD5+/CD23-; CD5-) LINFOCITOSI STABILI PER ALMENO 3 MESI OBIETTIVITA’ NEGATIVA POPOLAZIONI LINFOCITARIE CON FENOTIPO DA SLC MA CHE NON ESPRIMONO CATENE LEGGERE

Incidentally Identified Minute Clonal B-Lymphocyte Populations in Peripheral Blood and Bone Marrow

Clonal B cells (orange) in bone marrow with an immunophenotype characteristic of chronic lymphocyticleukemia

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE T: IMMUNOFENOTIPO FEATURE T-PLL LGL Leukemia Sezary Syndrome ATLL MORPHOLOGY prolymphocyte large granular lymphocytes cerebriform flower cell  CD4+/CD8- CD4-/CD8+ PHENOTYPE CD4+/CD8+ NK markers+ CD7+

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE T: IMMUNOFENOTIPO ISOFORME CD 45 ISOFORME CD 158 COME SURROGATI DI MONOCLONALITA’

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE T: IMMUNOFENOTIPO For T cell or NK cell malignancies, there is no convenient clonal marker that can be demonstrated by cell surface marker studies, although in many cases the finding of an abnormal T cell phenotype is strong evidence for a T cell malignancy. To prove clonality for T cell malignancies, gene rearrangement studies need to be performed

MFI= INDICE MEDIO DI FLUORESCENZA SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE INTENSITA’ DI ESPRESSIONE ANTIGENICA MFI= INDICE MEDIO DI FLUORESCENZA M1 CTR SmIg M2 Intensità media M2 Intensità media M1 MFI: intensità media M2 intensità media M1

B-Nor. B-LLC B-PLL HCL MCL FL IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ESPRESSIONE ANTIGENICA B-Nor. B-LLC B-PLL HCL MCL FL SmIg 176 35 970 176 222 266 CD5 60 141 // // 94 // CD23 38 53 // // // 33 FMC7 62 11 63 67 69 // CD20 333 121 // 953 395 637 CD11c 62 30 378 325 // // MFI

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LLC

CARATTERISTICO IN TUTTI GLI STADI LLC IMMUNOFENOTIPO: Linfociti B monoclonali CD5+, CD23+e SmIg a bassa intensità. CD19 CD 5 kappa SmIg CARATTERISTICO IN TUTTI GLI STADI CD23

IMMUNOFENOTIPO E PROGRESSIONE: LLC IN PROGRESSIONE MORFOLOGIA

LLC IN PROGRESSIONE IMMUNOFENOTIPO CD5 CD19 CD20 SmIg CD23

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: IMMUNOFENOTIPI ABERRANTI ASINCRONIA DI ESPRESSIONE ESPRESSIONE ABERRANTE VARIAZIONI DELLE CARATTERISTICHE FISICHE MALATTIA MINIMA RESIDUA

ESPRESSIONE ABERRANTE DI CD22 NELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE A BASSO GRADO LN NORMALE BM NORMALE L LINFOPLASMOCITICO LLC MCL L ZONA MARGINALE FCL HCL

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE MALATTIA MINIMA RESIDUA Approccio analitico multiparametrico Utilizzo di più combinazioni di marcatori Determinazione espressione antigenica più appropriata Determinazione della distribuzione delle catene leggere delle Ig

CD5 CD19 CD5 CD19 Determinazione selettiva delle catene leggere Ig mediante tripla marcatura sui linfociti CD19 positivi kappa R1 Gate CD19

CD5 CD19 kappa lambda Gate CD19 Determinazione selettiva delle catene leggere Ig mediante tripla marcatura sui linfociti CD19 positivi R1 Gate CD19 kappa lambda

ASSENZA MUTAZIONI GENI Ig SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI ESPRESSIONE CD38 > 30% ESPRESSIONE ZAP 70 > 20% ASSENZA MUTAZIONI GENI Ig RAPIDA PROGRESSIONE RIDOTTA SOPRAVVIVENZA

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI CD19 CD38 Espressione stabile correlata a malattia a intermedio-alto rischio Antigene a significato prognostico negativo Ematologia-Siena

COSA E’ ZAP-70?

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI ZAP-70 CD38 GUIPAUD, THE LANCET ONCOLOGY, 2003

R1 FSC SSC CD19 CD5 Ematologia-Siena

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI ZAP-70 CD38 GUIPAUD, THE LANCET ONCOLOGY, 2003

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI CD19 CD38 Espressione stabile correlata a malattia a intermedio-alto rischio Antigene a significato prognostico negativo Ematologia-Siena

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI CICLINE

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: BIOPSIA LINFONODALE AGOBIOPSIA BIOPSIA CHIRURGICA

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE CRONICHEAGOBIOPSIA + FCM

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: BIOPSIA CHIRURGICA MALTL MCL BCL -1 API2/MLT Marginal zone Germinal center Plasmacells Naive B cells Mantle BCL-6 Ig mutations ? CD5+ B-CLL/SLL Memory B cells BCL-2 PAX-5 Transformed DLCL p53 FL LPL p16

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: ASPIRATO E BIOPSIA MIDOLLARE non essenziali per la diagnosi ma utili in caso di morfologia atipica (es. LLC se presenza di centri di proliferazione e assenza di foci paratrabecolari) Monitoraggio effetto terapeutico (MMR)

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: GENETICA CITOGENETICA CONVENZIONALE FISH GENETICA MOLECOLARE GENOMICA PROTEOMICA

Incidenza di anomalie citogenetiche in pazienti con LLC Anomalie citogenetiche si riscontrano in circa l’80% dei pazienti con LLC (FISH) Dohner et al, NEJM 2000

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: GENETICA MOLECOLARE MALTL MCL BCL -1 API2/MLT Marginal zone Germinal center Plasmacells Naive B cells Mantle BCL-6 Ig mutations ? CD5+ B-CLL/SLL Memory B cells BCL-2 PAX-5 Transformed DLCL p53 FL LPL p16

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: GENOMICA

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: PROTEOMICA IPERPLASIA REATTIVA LINFOMA B

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE CRITERI DIAGNOSTICI MORFOLOGICI IMMUNOFENOTIPICI CITOGENETICI MOLECOLARI CLINICO-LABORATORISTICI