SISTEMA IMMUNITARIO Sistema complesso caratteristico dei vertebrati con funzioni di sorveglianza dell’ambiente interno e difesa dall’invasione di materiale ‘non-self’ (e quindi potenzialmente patogeno) L’osservazione della capacità di acquisire un’immunità verso molti patogeni è molto antica, Tucidide V sec. A.C. solo i sopravvissuti alla peste potevano curare i malati

1798  Jenner, primo vaccino contro il vaiolo Pasteur (1822-1895)  sviluppo anche di altri vaccini 1890  viene dimostrato che il siero di animali immunizzati contro la difterite è in grado di trasferire lo stato immune ad altri animali (risposta immunitaria umorale), solo nel 1930 vengono identificati i mediatori di questo trasferimento (gli anticorpi o immunoglobuline) In alcuni casi per il trasferimento dell’immunità è necessario il trasferimento di cellule (immunità cellulo-mediata)

Immunità innata e Immunità adattativa La prima è solo parzialmente specifica, interviene in tempi molto brevi, spesso è sufficiente a evitare il diffondersi dell’infezione Nei casi in cui ciò non si verifica entra in gioco la Risposta Immunitaria Adattativa

Risposta immunitaria adattativa è caratterizzata da: Specificità  Ag diversi inducono risposte diverse Diversificazione  capacità di rispondere a moltissimi Ag diversi Memoria  potenziamento in caso di secondo incontro con il medesimo Ag Non reattività verso il self E’ divisa in due fasi: RICONOSCIMENTO del ‘non-self’ RISPOSTA (neutralizzazione)

Risposta primaria e risposta secondaria

STRUTTURA DELLE Ig (mediatori della risposta adattativa)

Digestione parziale con enzimi proteolitici

L’IMPORTANZA DELLA REGIONE CERNIERA

La scoperta che individui affetti da mieloma multiplo (tumore derivato da una plasmacellula) producono in grande quantità Ig con un’unica specificità antigenica, ha reso possibile il sequenziamento delle catene leggere (L) e pesanti (H) delle Ig Il confronto delle sequenze ottenute da pazienti diversi ha evidenziato che sia le catene L che le H presentano una porzione Costante (ca.110 aa nelle catene L e ca. 330 o 440 nelle H) che è pressoché uguale in tutte le Ig e una porzione Variabile (ca. 110 aa sia per le catene L che per le H) specifica per la singola Ig

Sulla base della sequenza amminoacidica della porzione costante le catene pesanti possono essere suddivise in 5 differenti classi (e alcune classi possono essere suddivise in sottoclassi) che vengono indicate con lettere dell’alfabeto greco (a, g, d, e, m) Le catene leggere possono essere suddivise in 2 differenti tipi (k e l) e le k in sottotipi

Le catene pesanti g, d e a hanno 3 domini C Le catene pesanti m e e hanno 4 domini C

LE CINQUE CLASSI DI Ig

Le Ig vengono prodotte come proteine secrete o di membrana

LE TRE REGIONI IPERVARIABILI (CDR = Complementarity Determining Region) DEL DOMINIO VARIABILE Le CDR delle catene L ed H vengono a trovarsi spazialmente vicine nella struttura quaternaria  sito di legame per l’Ag

Differenze isotipiche Individui della stessa specie presentano tutti gli stessi isotipi. Il numero di diversi isotipi varia da specie a specie Differenze allotipiche Si riscontrano tra individui della stessa specie Differenze idiotipiche Si riscontrano tra linfociti B dello stesso individuo

La struttura delle Ig presenta alcune caratteristiche difficili da conciliare con i modelli genetici classici dell’epoca in cui la loro struttura è stata in gran parte chiarita Enorme diversità (= grande repertorio, dell’ordine di 108 -109) in ciascun individuo Presenza nella stessa molecola di una regione variabile (sostanzialmente unica, cioè presente solo in quel clone cellulare) e di una regione costante condivisa da molti cloni Presenza di Ig di classi diverse ma con la stessa specificità antigenica

1965 - Dreyer e Bennett ipotizzano che sia le catene pesanti che le leggere siano codificate da due segmenti genici distinti che in qualche modo ad un certo stadio dello sviluppo dei linfociti riarrangiano e formano un unico gene che viene trascritto e tradotto (viene contraddetto il dogma un gene  una catena polipeptidica) Essi inoltre ipotizzano l’esistenza di molti (centinaia o migliaia) segmenti V e di pochi segmenti C

Solo nel 1976 si è avuta la prova definitiva della sostanziale esattezza di questa ipotesi Hozumi e Tonegawa  confronto tra i DNA estratti da cellule di mieloma e da cellule embrionali digeriti con RE e ibridati con due sonde: una corrispondente al completo mRNA della Ig, l’altra ottenuta dalla porzione 3’ dell’mRNA della Ig  il pattern di bande ottenute con queste due sonde è diverso nei due DNA

Sonda mRNA completo: due bande dal DNA embrionale e una sola dal DNA di mieloma (diversa dalle due del DNA embrionale) Sonda mRNA 3’: una sola banda sia dal DNA embrionale che da quello di mieloma ma di dimensioni diverse

Organizzazione dei cluster genici delle catene leggere e delle catene pesanti delle Immunoglobuline nell’uomo

Catene L: il riarrangiamento (V-J) a livello di DNA porta alla formazione di un gene funzionante

Catene pesanti: ricombinazione V-D-J

Il linfocita B maturo che non ha ancora incontrato l’Ag esprime mIgM e mIgD Splicing alternativo

La porzione Variabile è codificata dai segmenti genici riarrangiati: V e J nelle catene leggere V, D e J nelle catene pesanti

Il riarrangiamento avvicina sequenze Promotrici e sequenze Enhancer

Grandezza del repertorio anticorpale generato dall’unione dei diversi tipi di segmenti (diversità combinatoriale) Il no. esatto dei segmenti V e D non è noto e probabilmente varia da individuo a individuo La diversità combinatoriale genera un repertorio grande, ma inferiore a quello che realmente ciascuno di noi ha Quali sono gli altri meccanismi responsabili della grande variabilità osservata?

COME AVVIENE LA RICOMBINAZIONE DEI VARI SEGMENTI GENICI ? Sono necessarie sequenze segnale che fiancheggiano le regioni che devono essere unite e sistemi enzimatici (sia ubiquitari che linfocita-specifici)

STRUTTURA DELLE SEQUENZE SEGNALE (RSS = Recombination Signal Sequence)

Struttura delle RSS e loro localizzazione regola one-turn, two-turn

Riconoscimento delle RSS da parte di RAG-1 e RAG-2 (complesso enzimatico linfocita-specifico) e sinapsi delle RSS  i due segmenti genici vengono avvicinati Taglio di un singolo filamento di DNA Taglio del secondo filamento e formazione di ‘forcine’ a protezione delle estremità tagliate Taglio casuale delle forcine Riunione delle estremità catalizzata dal complesso enzimatico DSBR (Double Strand Break Repair)

Le forcine vengono spesso tagliate in modo da creare estremità ‘appiccicose’  vengono aggiunti nt. (P = palindromici); altra fonte di variabilità è l’aggiunta e/o la delezione di altri nt. (N)

Aggiunta di nucleotidi P e N

Linfociti che utilizzano gli stessi segmenti generano geni diversi

Il prezzo da pagare è la possibilità che si verifichino riarrangiamenti non produttivi  si stima che solo nel 10% dei pre-linfociti si verifichino riarrangiamenti produttivi per le catene L e per le H

I punti di giunzione possono variare I punti di giunzione possono variare. Questa flessibilità giunzionale può dare origine a riarrangiamenti non produttivi Si stima che solo nel 10% dei pre-linfociti si verifichino riarrangiamenti produttivi per le catene L e per le H

In ciascun linfocita B viene espresso un solo allele per le catene pesanti ed un solo allele per le catene leggere (esclusione allelica)

MATURAZIONE DEI LINFOCITI B Riarrangiamento dei segmenti genici della catena pesante  produzione di catene m (e d) da un solo allele Riarrangiamento dei segmenti genici della catena leggera k  produzione di una IgM (e IgD) completa (con catene k prodotte da un solo allele) Se lo step 2. non è stato produttivo, si ha riarrangiamento dei segmenti genici della catena l  produzione di una IgM completa (con catene l prodotte da un unico allele) Se non si arriva alla formazione di un gene VH E di un gene VL funzionanti il pre-linfocita non sarà in grado di produrre alcuna Ig e morirà per apoptosi

Riarrangiamento produttivo del 1° allele  blocca il riarrangiamento del 2° allele – Nessuno dei due alleli effettua un riarrangiamento produttivo  morte per apoptosi

Origine della variabilità nelle tre CDR

Ig dello stesso isotipo e con uguale regione V vengono prodotte sia come proteine di membrana che secrete attraverso un meccanismo di splicing alternativo

Eventi di splicing alternativo producono anche Ig con la stessa regione variabile ma diversa regione costante

Un altro fenomeno caratteristico dei linfociti B è l’ipermutazione somatica  avviene solo in seguito al legame con l’Ag

Il processo di ricombinazione somatica per generare le catene H e L delle Ig espone i linfociti al rischio di riarrangiamenti cromosomici anche al di fuori dei cluster dei geni per le Ig

Riarrangiamenti tra RSS ‘vere’ (nere) e sequenze RSS simili  traslocazioni o delezioni

Le cellule del sistema immunitario con funzioni di riconoscimento

TCR = T Cell Receptor Proteina di membrana dei linfociti T, scoperta e caratterizzata all’inizio degli anni ’80, non esiste la forma secreta

TCR = T Cell Receptor

I cluster genici del TCR nell’uomo

La ricombinazione dei segmenti genici del TCR

I meccanismi di generazione della diversità nelle Ig e nei TCR

Il tipo di risposta effettrice dipende da quale cellula ha riconosciuto l’antigene (linfocita B, TH o TC)

Linfociti B e T diversi producono BCR e TCR diversi perché HANNO geni diversi e NON perché ESPRIMONO geni diversi BCR e TCR  il repertorio (capacità di riconoscimento) della singola cellula è 1, il repertorio dell’individuo è elevatissimo (108)