CLONAGGIO DI UN FRAMMENTO GENOMICO NEL VETTORE pUC
(induttore)
Agar agar: miscela di polisaccaridi estratta da alcuni tipi di TRASFORMAZIONE di CELLULE COMPETENTI E PIASTRAMENTO SU PIASTRE DI AGAR E TERRENO CONTENTI AMPICILLINA E X-GAL Agar agar: miscela di polisaccaridi estratta da alcuni tipi di alghe rosse
CRESCITA OVER-NIGHT A 37°C
SINGOLI CLONI BATTERICI PRELEVATI E CRESCIUTI IN COLTURA LIQUIDA
MIDIPREP MAXIPREP MINIPREP Grandi preparazioni di plasmide da utilizzare per diversi scopi: sequenziamento espressione del prodotto genico trasfezioni in cellule eucariotiche Piccola preparazione di plasmide per verificare il clonaggio: migrazione elettroforetica PCR sequenziamento
CENTRIFUGAZIONE E RACCOLTA DELLE CELLULE IN UN PELLET
LE CELLULE VENGONO RISOSPESE NELLA SOLUZIONE I LEGGERMENTE IPOTONICA
SI AGGIUNGE SOLUZIONE II (LISI ALCALINA, pH = 12,0-12,5) CON NAOH E SDS
SI AGGIUNGE SOLUZIONE III CON K- ACETATO (NEUTRALIZZANTE pH = 7,0) Il DNA genomico non si rinatura e si riaggrega in una massa aggrovigliata che forma insieme a proteine e membrane un aggregato biancastro facilmente separabile dalla fase liquida mediante centrifugazione.
Si preleva il spn e si aggiunge ad una miscela di egual volume di fenolo-cloroformio (1:1) I solventi organici fanno precipitare le proteine all’interno del solvente e nell’interfaccia
Si preleva la fase acquosa che contiene il DNA e vi si aggiunge alcol (etanolo o isopropanolo) In presenza di cationi monovalenti (come Na+) il DNA precipita e viene recuperato dopo centrifugazione
Si risospende il pellet DNA con Tampone TE 1x (Tris-HCL + EDTA) Caricamento di una piccola aliquota su gel di agarosio in cui è presente EtBr
Illuminando il gel con luce UV l’EtBr emetta fluorescenza rosa Il colorante EtBr si intercala tra le basi adiacenti nella doppia elica del DNA Illuminando il gel con luce UV l’EtBr emetta fluorescenza rosa
Plasmide: DNA circolare 3000-6000 bp
circolare circolare linearizzato linearizzato superavvolto superavvolto