Capacitazione in vitro dello spermatozoo e Reazione Acrosomiale Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione degli Animali Domestici (AA 2016/17) Corso di Biotecnologie della Riproduzione Prof.ssa M.E. Dell’Aquila Capacitazione in vitro dello spermatozoo e Reazione Acrosomiale Albrizio et al. Reproduction 2004

Sommario Definizioni Aspetti storici Fisiologia capacitazione/AR in vivo Procedure in vitro Valutazione efficienza procedure in vitro Uso di seme fresco e congelato

Definizioni: Capacitazione Insieme dei cambiamenti fisiologici reversibili ai quali lo spermatozoo va incontro quando entra in contatto con il tratto genitale femminile: Riorganizzazione proteine di membrana; Metabolismo fosfolipidi di membrana; Riduzione livelli di colesterolo; Iperattivazione

Definizioni: Reazione Acrosomiale Evento esocitotico irreversibile degli enzimi litici contenuti nell’acrosoma

Aspetti storici Austin, 1951 Chang, 1951 Iritani and Niwa, 1971 Yanagimachi, 1990

Maturazione morfo-funzionale dello spermatozoo Tratto riproduttivo maschile Maturazione meiotica Maturazione morfologica Acquisizione della motilità Acquisizione antigeni per capacità fecondante Tratto riproduttivo femminile Capacitazione/Reazione Acrosomiale

Flesh & Gadella. Biochim Biophys Acta 2000.

Flesh & Gadella Biochim Biophys Acta 2000.

A N I C Capacitazione = Eparina e = Calmodulina = Proteina plasma seminale = Fosfolipide colinico

Reazione Acrosomiale Fusione membrana plasmatica e acrosomiale esterna Esocitosi enzimi litici acrosomiali

Capacitazione del Seme e Reazione Acrosomiale Legame reversibile proteine plasma seminale alla membrana dello spz Legame glicosamminoglicani a proteine plasma seminale Liberazione siti fosfolipidi colinici Modificazione configurazione sterica calmodulina Ingresso ioni calcio Attivazione fosfolipasi A Sintesi lisofosfatidilcolina Fusione membrana plasmatica con membrana acrosomiale esterna

Flesh & Gadella. Biochim Biophys Acta 2000.

Procedure di capacitazione in vitro Separazione della frazione ad alta motilità Percoll gradient Swim up

Flesh & Gadella. Biochim Biophys Acta 2000.

Valutazione delle procedure di capacitazione Staining techniques Microscopia in fluorescenza: CTC-Hoechst, Flow Cytometry Oocyte penetration tests Microscopia elettronica: penetrazione di ZP congelate Sperm-zona binding Microscopia in fluorescenza

HOECHST 33258 B A PROTOCOLLO SPERIMENTALE: COLORANTE SOPRAVITALE FLUORESCENTE NON INTERCALANTE CON SPECIFICITA’ PER ADENINA E TIMINA . EMETTE LUCE DI COLORE CELESTE/BLU A 420 nm SE COLPITO DA LUCE CON LUNGHEZZA D’ONDA 330-380 nm PERMETTE DI EVIDENZIARE SPERMATOZOI VIVI (A) OPPURE MORTI (B), IN BASE ALL’ INTEGRITA’ DELLA MEMBRANA E QUINDI ALLA CAPACITA’ O MENO DI POTER PENETRARE NELLA CELLULA B A PROTOCOLLO SPERIMENTALE: aggiungere 0.5 ml di soluzione Hoechst 33258 (10 mg/ml) a 50 ml di seme derivante dal trattamento con la sostanza da testare incubare per 2’, aggiungere 500 ml di 2% PVP e centrifugare a 900xg per 5’ rimuovere il sovranatante e risospendere il pellet in 45 ml di TALP, quindi procedere con il trattamento con CTC Albrizio et al. Reproduction 2004

CHLORTETRACYCLINE (CTC) E’ UN ANTIBIOTICO IN GRADO DI LEGARSI A REGIONI IDROFOBICHE DELLA MEMBRANA IN MODO CALCIO-DIPENDENTE. EMETTE LUCE DI COLORE VERDE A 470 nm SE COLPITO DA LUCE CON LUNGHEZZA D’ONDA 400-440 nm PERMETTE DI EVIDENZIARE SPERMATOZOI NORMALI (A), CAPACITATI (B) E CON REAZIONE ACROSOMIALE (C), IN BASE AI DIVERSI PATTERNS CHE SI MANIFESTANO PER I CAMBIAMENTI DELLA MEMBRANA A B C Albrizio et al. Reproduction 2004 PROTOCOLLO SPERIMENTALE: sciogliere 0.0019 g di CTC e 0.0044 g di L-cisteina in una soluzione contenente Tris 20mM, NaCl 130mM a pH=7.8 miscelare 50 ml di spermatozoi derivanti al trattamento con Hoechst 33258 con 50ml di soluzione di CTC aggiungere 15 ml di glutaraldeide al 12.5% in Tris 1M pH=7.0 per fissare montare i vetrini mettendo 5 ml della miscela spermatica e osservare entro 1 ora

Analisi citofluorimetriche

Merocyanine 540/Yo-Pro-1 staining Analisi citofluorimetrica dello stato di capacitazione Cellule spermatiche in Tyrodes Medium/bicarbonato contenente: 2.7 M di Merocyanine 540 (sensibile alle variazioni fosfolipidiche della membrana) 25nM di Yo-Pro-1 (specifico per gli acidi nucleici relativamente impermeabile alle membrane) 0.5mg/ml PVA 0.5mg/ml PVP Incubare in un bagnetto riscaldato a 37°C per 30 min Analisi citofluorimetrica della capacitazione è condotta con FACS Vantage SE: Merocyanine 540/Yo-Pro-1 sono eccitati da un laser a ioni di Argon ad una =488 nm. La fluorescenza è misurata a  di emissione rispettivamente a 520 e 575 nm. Vengono analizzate 8.000-10.000 spermatozoi al secondo.

FITC-PNA/PI staining Analisi citofluorimetrica della reazione acrosomiale Incubare le cellule spermatiche con 5g/ml di FITC-PNA (marker per la reazione acrosomiale) e 1M di PI (marker per le cellule morte). Analisi con FACS scan

SYBR 14/PE-PNA/PI staining Valutazione citofluorimetrica simultanea della vitalità e dell’integrità dell’acrosoma Aggiungere ad 1 ml di seme diluito: 100 nM SYBR-14 (*componente A, diluito 10 volte in DMSO) 2.5 mg/ml PE-PNA (in tampone come Nagy et al., 2003 ) 12 mM PI (*componente B non diluito) * LIVE/DEAD Sperm Viability kit, Molecular Probes, OR, USA Nagy et al., 2003 Biol Reprod 68, 1828-35.

Uso di seme fresco e congelato Le procedure di congelamento incidono sulla vitalità del seme Le procedure di congelamento incidono sullo stato di capacitazione e di reazione acrosomiale degli spermatozoi

Letture consigliate Gordon I.“Capacitating bovine sperm” In: “Laboratory production of cattle embryos” CABI Publishing Dublin 2003 II ed., Chapter 5. Flesh FM & Gadella BM. Dynamics of the mammalian plasma membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 2000; 1469: 197-235. Rathi et al.,2001. Evaluation of in vitro capacitation of stallion spermatozoa. Biol Reprod 65: 462-470. Nagy et al., 2003. A triple stain flow cytometric method to assess plasma- and acrosome-membrane integrity of cryopreserved bovine sperm … Biol Reprod 68:1828-1835.