Struttura della particella virale (Dane particle) Ponti disolfuro Fosfolipidi Proteina capsidica superficiale (HBsAg) Polimerasi virale DNA virale Proteina capsidica interna (HBcAg) 45 nm Particelle usate come vaccini: da siero da lievito proprietà immunogeniche dei fosfolipidi e ponti disolfuro (assenti o ridotti in particelle da lievito) 22 nm Produzione di HBsAg in pianta: Alternativa potenzialmente più economica alla produzione in lievito Prospettiva di produzione tessuto-specifica Prospettiva di produzione in forma edibile

Costruzione dei vettori di espressione Vettori commerciali per E. coli / A. tumefaciens: marcatore batterico neomicina fosfotrasferasi (NPT) con promotore/terminatore della nopalina sintasi (NOS) HBsAg con promotore forte e costitutivo CaMV35S (pHB101) HBsAg con promotore CaMV dotato di doppio enhancer di trascrizione (Dual) ed enhancer di traduzione (TEV) (pHB102) terminatore NOS e sequenze di bordo destro e sinistro (RB e LB)

Protocollo: Trasformazione di A. tumefaciens con i vettori pHB101 e 102 Trasformazione tessuto fogliare di tabacco con A. tumefaciens Selezione cloni vegetali resistenti Trasferimento cloni e sviluppo piante trasformate Estratto proteico e RNA da foglie Analisi quantitativa RNA (fig. 2A) e materiale immuno-reattivo con anticorpi anti HBsAg (fig. 2B) Oppure: Passaggio estratto su colonna con anticorpo anti-HBsAg Eluizione frazione immuno-reattiva Analisi microscopica eluato (fig. 3)

Analisi RNA e proteine estratte da foglie: Pista 1: non trasf. Piste 2-6: trasf. pHB101 Piste 7-9: trasf. pHB102 Trasf. pHB101: tanto RNA, poca proteina Trasf. pHB102: poco RNA, tanta proteina Effetto TAV prevalente sul Dual CaMV? Quantità RNA dipende da locus di integrazione e copie integrate Taglia mRNA consistente con le dimensioni previste Quantità di proteina: fino a 60 ng/mg

Analisi materiale immuno-reattivo eluito da colonna: Particelle 10-40 nm (valore medio 16-24 nm) Capacità di autoassemblaggio Dimensioni simili a quelle umane (22 nm) e di lievito (17 nm)

Caratteristiche delle particelle: Sedimentazione in gradiente di saccarosio con picco largo prima del 60S ribosomale (picco a 280 nm) Profilo di sedimentazione coerente con i dati dimensionali (distribuzione dei valori in fig.3) Particelle umane più omogenee (picco più netto) e più piccole (55S) Densità delle particelle da pianta minore (1.16 g/ml) di quelle umane (1.2 g/ml) valutata con gradiente di CsCl (fi. 5)

Localizzazione particelle in pianta non effettuata Meccanismi di assemblaggio ancora da definire esattamente: Nel fegato le particelle composte da HBsAg si trovano nel ER (via di secrezione) HBsAg ha 2 domini trans-membrana per orientare correttamente la proteina HBsAg fa parte di una proteina più grande ma anche senza pre-S si assembla sia in uomo che in lievito

Ottenimento di piante GM stabili Produzione di HBsAg CONCLUSIONI Ottenimento di piante GM stabili Produzione di HBsAg HBsAg da pianta riconosciuto da anticorpi monoclonali specifici Capacità di assemblaggio Rese: HBsAg = 0.01% della proteina solubile di foglia Rese: ancora basse per poter produrre un vaccino Possibilità di aumentare la produzione utilizzando altri elementi regolativi della trascrizione Modificazioni post-traduzionali da verificare (glicosilazioni, ponti S-S) Mason HS et al. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:11745-11749 Bibliografia aggiuntiva: Glick BR e Pasternak JJ Biotecnologia molecolare - Zanichelli