ENTRIAMO IN LABORATORIO …

III° FASE VISUALIZZARE I PRODOTTI DI PCR

Metodi di separazione su matrici semisolide: gel, polimeri Metodi di rilevazione Ci permettono di stabilire con precisione le caratteristiche del DNA

Metodi elettroforetici manuali o automatici che possono essenzialmente generare due profili A bande A picchi

Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato In genetica viene applicata per separare i frammenti di DNA

Elettroforesi su gel Si preparano i gel di agarosio o acrilamide, che costituiscono una “matrice a setaccio” Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i campioni da analizzare e viene applicato un campo elettrico La direzione di migrazione dipende dalla carica delle molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente, migreranno verso il polo positivo La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del frammento di acido nucleico Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni (peso molecolare)

Elettroforesi su gel Esempio di PCR del gene della distrofina Paziente G: delezione

Elettroforesi su gel

Elettroforesi capillare Prevede la migrazione dei campioni entro un capillare di ridotte dimensioni E’ il sistema utilizzato dagli strumenti automatizzati che consentono l’analisi della dimensione e della sequenza dei campioni

An ABI Prism 310 Genetic Analyser Capillary tube Sample tray Note-other models of this Analyzer have more capillary tubes and can process more samples at a time, but this model is sufficient for the demand for testing to date through DNA Diagnostics

Elettroforesi capillare I campioni sono amplificati utilizzando primers fluoriscinati ( contengono fluorocromi) Si utilizzano dei sottilissimi capillari( diametro 10-100micron) che possono avere una lunghezza tra 30-50 cm entro i quali viene caricato un polimero che svolge la stessa funzione dei gel nell’elettroforesi tradizionale Il caricamento del campione è automatico Agli estremi del capillare viene applicato un campo elettrico; la velocità di corsa dipende dalla grandezza del frammento Un raggio laser eccita i florocromi che emettono fluorescenza Tale segnale viene registrato da un rilevatore ed il risultato consiste in un picco di fluorescenza rilevato ad un determinato tempo della corsa elettroforetica

Elettroforesi capillare Analisi della dimensione del campione (separazione dei frammenti sulla base delle loro dimensioni) Analisi della sequenza del campione ( mediante la tecnica del sequenziamento diretto)

Elettroforesi capillare Riduzione di 14 volte della velocità di corsa L’efficienza del sistema di caricamento consente l’analisi di una minore quantità di campione

13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions TPOX D3S1358 TH01 D8S1179 D5S818 VWA FGA D7S820 CSF1PO AMEL D13S317 AMEL D16S539 D18S51 D21S11