PRODUZIONE DI PROTEINE DA GENI CLONATI IN PROCARIOTI

fermentatore

BIOTECNOLOGIE: USO DEI PROCESSI BIOLOGICI NELL’INDUSTRIA E PRODUZIONE INDUSTRIALE DI PROTEINE DA COLTURE IN CELLULE PROCARIOTICHE EUCARIOTICHE (LIEVITI E FUNGHI) COMPOSTO MICRORGANISMO Antibiotici Penicilline Penicillium spp. Cefalosporine Cephalosporium spp Cloramfenicolo, streptomicina Streptomyces spp. Enzimi Proteasi, amilasi Bacillus ssp. (batterio), Aspergillus spp. Alcool S. cerevisiae Aceto S. cerevisiae ac. Acetico Acetone Clostridium ssp. (batterio) BIOTECNOLOGIE: USO DEI PROCESSI BIOLOGICI NELL’INDUSTRIA E NELLA TECNOLOGIA

PRODUZIONE DI PROTEINE A PARTIRE DA GENI CLONATI Espressione di geni esogeni in procarioti Riconosciuto dalla subunità sigma RNA pol E. coli Formazione struttura a loop

Sequenze promotore in procarioti e eucarioti riconosciute da RNA polimerasi specifiche

VETTORI SPECIFICI PER ESPRESSIONE DI GENI ETEROLOGHI IN PROCARIOTI Vettori a cassetta

Monitoraggio della proteina eterologa con possibili effetti dannosi sul procariote

promotore tac: ibrido tra trp e lac Ceppo speciale di E. coli lisogeno per T7 (fago T7 integrato e alterato: gene per RNA pol T7 a valle del promotore lac, indotto dall’IPTG )

SVANTAGGI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI Non vengono rimossi eventuali introni Limite della lunghezza amminoacidica Possibile formazione di strutture secondarie della porzione iniziale trascritto (fig) Possibile produzione di proteine ibride di fusione Possibile presenza di segnali di terminazione per il batterio (fig) Propensione per alcuni codoni (fig) Mancanza di modificazioni post-traduzionali (glicosilazioni, fosforilazioni, etc.) Mancato ripiegamento della struttura terziaria e sovraespressione determinano i corpi di inclusione

Vettori a cassetta per la fusione di geni in E. coli Fusione con parte iniziale di gene batterico Aumento resa e solubilità proteina eterologa Vantaggi di una proteina di fusione in frame: presenza seq. nucleotidica di E. coli per legame ribosoma peptide batterico iniziale stabilizzante peptide batterico iniziale da utilizzare come segnale localizzazione cellulare (esportata nel mezzo di coltura o tra membrana esterna ed interna)

Formazione di strutture secondarie all’inizio del trascritto quali possibili conseguenze per inserimento di sequenza esogena

Fusione con la proteina di E Fusione con la proteina di E. coli Glutatione-S-Transferasi (GST) e purificazione con cromatografia per affinità al substrato (glutatione) Vettore: componente N-terminale della GST, componente C-terminale proteina da purificare. Promotore Lac inducibile libero Glutatione: tripeptide (cisteina, glicina, ac. glutammico)

Rimozione della proteina di fusione es: con bromuro di cianogeno (se alla giunzione c’è metionina), con trombina (taglia adiacente a residui di arginina). Non deve essere tagliata all’interno la proteina di interesse!

Proteina priva di struttura terziaria precipita e forma corpi di inclusione. Aggregati recuperati in forti condizioni denaturanti che non permettono corretto ripiegamento in vitro della proteina che quindi sarà inattiva! Utilizzo ceppi batterici privi di proteasi responsabili della degradazione

Produzione di proteine eterologhe - studi biochimici e funzionali, cristallografici - produzione anticorpi specifici

SVANTAGGI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI Non vengono rimossi eventuali introni Limite della lunghezza amminoacidica - Possibile formazione di strutture secondarie della porzione iniziale del trascritto Possibile presenza di segnali di terminazione per il batterio Propensione per alcuni codoni - Mancanza di modificazioni post-traduzionali (ponti disolfuro, glicosilazioni, fosforilazioni, acetilazione, carbossilazione, etc.) Mancato ripiegamento della struttura terziaria e sovraespressione determinano i corpi di inclusione

Screening cloni batterici trasformati con vettori di espressione

Screening cloni batterici trasformati con vettori di espressione

BIOTECNOLOGIE: USO DEI PROCESSI BIOLOGICI NELL’INDUSTRIA E PRODUZIONE INDUSTRIALE DI PROTEINE DA COLTURE IN CELLULE PROCARIOTICHE E EUCARIOTICHE (LIEVITI E FUNGHI) COMPOSTO MICRORGANISMO Antibiotici Penicilline Penicillium spp. (fungo) Cefalosporine Cephalosporium spp (fungo) Cloramfenicolo, streptomicina Streptomyces spp. (batterio) Enzimi Proteasi, amilasi Bacillus ssp. (batterio), Aspergillus spp. (fungo) Alcool S. cerevisiae Aceto S. cerevisiae ac. Acetico Acetone Clostridium ssp. (batterio) BIOTECNOLOGIE: USO DEI PROCESSI BIOLOGICI NELL’INDUSTRIA E NELLA TECNOLOGIA

VETTORI DI CLONAGGIO PER GLI EUCARIOTI Lieviti e funghi filamentosi: produzione di proteine eterologhe anche a scopi biotecnologici con sintesi di prodotti medicinali o alimentari Saccharomyces cerevisiae Fungo unicellulare Ruolo fondamentale per produzione di birra e pane Vantaggi: conoscenza genetica e biochimica, facilità di coltura, alta resa Possibile utilizzo per clonaggio del plasmide naturale 2 µm Svantaggi: iperglicosilazione, difficoltà di secrezione delle proteine prodotte nel terreno di coltura, propensione per un codone

PROMOTORI UTILIZZATI IN VETTORI DI ESPRESSIONE PER EUCARIOTI MICROBICI Galattosio epimerasi

Saccharomyces cerevisiae plasmide naturale 6,3 kb, tra 70-200 copie risiede nel nucleo, si replica autonomamente, segrega sia in meiosi che in mitosi REP1 e REP2 (per replicazione) FLP (proteina che riconosce siti specifici nel DNA del lievito: integrazione per ricombinazione ) Ori D = funzione ignota

Saccharomyces cerevisiae Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp Procedura - clonaggio in sequenze di pBR322 selezione dei ricombinanti in E. coli (resistenze antibiotici) - inserimento in lievito e selezione (LEU2)

Saccharomyces cerevisiae Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp

Saccharomyces cerevisiae Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp Solo occasionalmente si integra Ricombinazione omologa tra geni LEU 2 Solo una copia di LEU2 funziona

Saccharomyces cerevisiae Plasmide integrativo di lievito: YIp = plasmidi batterici (pBR322) con resistenza antibiotici per selezione in batteri + URA3 (gene di lievito per la selezione) Non contiene i geni di 2 µm (REP e ori) e non si può replicare se non si integra nel DNA dei cromosomi di lievito, stesso meccanismo di YEp

Saccharomyces cerevisiae Criteri di scelta: efficienza di trasformazione, numero di copie, stabilità YIp: ideale per stabilità in coltura a lungo termine

Saccharomyces cerevisiae Caratteristiche del clonaggio in YEp: Frequenza di trasformazione molto alta: da 10000 a 100000 cellule trasformate per microgrammo di DNA plasmidico Alto numero di copie: tra 20 e 50 per cellula Svantaggi: nel processo di gemmazione spesso copie YEp non segregano nella cellula figlia QUINDI ALTA PRODUZIONE PROTEINA DEL GENE CLONATO MA INSTABILITA’ DELLA TRASFORMAZIONE Caratteristiche del clonaggio in YIp: Frequenza di trasformazione bassa: 1000 cellule trasformate per microgrammo di DNA plasmidico per bassa efficienza di integrazione cromosomica E’ presente in una sola copia per cellula QUINDI BASSA PRODUZIONE PROTEINA DEL GENE CLONATO MA GRANDE STABILITA’ DELLA TRASFORMAZIONE PER LUNGHI PERIODI DI COLTURA

Saccharomyces cerevisiae UTILIZZO DI Yip per sostituire un gene esistente mutante (X2) con uno wt (X1) per inserzione dell’intero plasmide YIp

Svantaggi dell’utilizzo di Saccharomyces cerevisiae Iperglicosilazione, difficoltà di secrezione delle proteine prodotte nel terreno di coltura, propensione per un codone Esempio di glicosilazione dell’asparagina. L’iperglicosilazione di alcuni funghi può provocare reazione antigenica se la proteina è iniettata