POSTGENOMICA O GENOMICA FUNZIONALE Analisi della sequenza genomica per identificare geni, sequenze di controllo, e tutti gli altri elementi che contribuiscono all’espressione di geni specifici e del genoma nel suo insieme e Studio del trascrittoma: studio dei trascritti di una cellula per comprendere lo schema di espressione del genoma nel suo insieme Tecnica: microarray di espressione Studio della variabilità cellulare dell’espressione genica Tecnica: PCR quantitativa (RealTime PCR) Studio del proteoma: studio del contenuto proteico di una cellula per comprendere tutte le sue capacità biochimiche Tecnica: microarray di proteine

Analisi di una libreria di cDNA attraverso microarray Microarray: deposizione (“stampa”) su vetrino di materiale particolare di microscopiche gocce. Ogni spot è uno specifico cDNA ottenuto per PCR gene-specifica dopo trascrizione inversa. Assetto ordinato in griglie dell’ intera libreria di cDNA. Campione: estrazione di RNA cellulare, conversione a cDNA con marcatura con fluorescenza di tutti i cDNA (diversa fluorescenza per i diversi campioni cellulari) Ibridazione ed esame microarray secondo tipo cellulare un tipo cellulare

Studio del trascrittoma attraverso microarray con cDNA Esempio: valutazione dell’ espressione genica nel campione sperimentale trattato Esperimento Es: trattamento farmaco Esperimento: trattamento farmaco Immagine combinata controllo

Studio del trascrittoma attraverso chip a DNA Microarray ad alta densità con oligo sintetizzati in superficie (1 milione/cm2); Uno o più oligo corrispondono ad un DNA (gene) espresso

Studio del trascrittoma attraverso microarray con cloni di DNA

Studio del trascrittoma attraverso chip a DNA

Studio del trascrittoma attraverso chip a DNA Chip con 1046 cDNA Chip con 65000 oligonucleotidi rappresentante 1641 geni

Studio del proteoma La differenza tra due proteomi si può osservare confrontando lo schema delle macchie Purificazione proteina da gel Identificazione della composizione amminoacidica in funzione del rapporto tra massa e carica

Valutazione dell’espressione di un gene: Real-Time PCR o PCR Quantitativa Valutazione dell’espressione di un gene: Retrotrascrizione dell’RNA totale in cDNA Amplificazione gene specifica del cDNA con Real-Time PCR Valutazione del prodotto PCR ottenuto durante la fase esponenziale Log [DNA] N° cicli Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile

Real-Time PCR o PCR Quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione con computer Misurazione in tempo reale del prodotto di PCR ottenuto durante la fase esponenziale, quando l’efficienza è infuenzata minimamente dalle variabili di reazione Il prodotto di PCR incrementa esponenzialmente con il numero di cicli (n) e dipende dal numero di copie di stampo di partenza (T): P = (2)n T Incremento di fluorescenza

Real-Time PCR o PCR Quantitativa Linea soglia scelta dall’operatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold CT = cycle Threshold

Real-Time PCR o PCR Quantitativa Cicli di amplificazione Fluorescenza Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di campione iniziale

Plot di amplificazione Numero di cicli CT Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (-actina, GAPDH, HPRT, etc)

Real-Time PCR o PCR Quantitativa La fluorescenza si genera durante la PCR mediante l’impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti Quantificazione assoluta: i campioni sono quantificati in modo assoluto, occorre una curva standard Quantificazione relativa: Confronto dei CT dei diversi campioni. Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.