CARATTERIZZAZIONE DI UN GENE CANDIDATO Ricostruzione della sequenza genomica completa attraverso un contiguo di cloni 2. Identificazione della sequenza codificante: ibridazione con librerie di cDNA, analisi bioinformatiche (confronto con regioni «consensus» in banche dati) Ricerca delle sequenze regolatrici (Fusione con gene reporter) Ricerca della sequenze 5’ e 3’ UTR Localizzazione del sito di inizio della trascrizione (Primer extension)
Ricerca delle sequenze regolatrici
Ricerca delle sequenze regolatrici attraverso l’analisi di regioni con delezioni fuse con un gene reporter
Ricerca delle sequenze regolatrici attraverso l’analisi di regioni con delezioni fuse con un gene reporter
Saggi in vivo su cellule in coltura con geni reporter CAT: catalizza il trasferimento di gruppi acetile dall’Acetil-CoA (marcato in C14) al cloramfenicolo (autoradiografia) GFP: proteina che deriva da una medusa (fluorescenza agli UV) LUC: gene della luciferasi, luce prodotta in presenza di luciferina, O2, Mg2+ e ATP
Ricerca degli elementi regolativi di un gene: analisi delle delezioni nel promotore
VETTORI CON GENI REPORTER - Scelta del vettore con un gene reporter e del tipo di cellula ospite Clonaggio della ipotetica sequenza regolatrice che deve essere riconosciuta dai fattori di trascrizione della cellula ospite - Comparsa nuovo fenotipo identificabile con saggio semplice Luciferasi (gene luc della lucciola americana) pGL2-Basic vettore espressione eucariotico Trasfezione in cellule eucariotiche Estratto cellulare + luciferina impulsi luminosi (luminometro)
Ricerca degli elementi regolativi di un gene: analisi delle delezioni nel promotore del gene umano per il fattore VIII
ANALISI DELL’ESPRESSIONE DI UN GENE CANDIDATO Ricostruzione dell’intero cDNA attraverso ibridazioni con librerie di cDNA Sequenziamento del/i cDNA relativi al gene e confronto con il DNA genomico Inserimento cDNA in vettore di espressione Produzione del relativo mRNA e sua analisi: - analisi della localizzazione cellulare (produzione di ribosonde antisenso per ibridazione in situ in cellule o tessuti) - analisi della funzione (produzione di ribosonde antisenso per RNA interference) ed esame del cambiamento di espressione di altri geni/proteine 5) Espressione in cellule procariotiche o eucariotiche Produzione di proteina per: - studi biochimici e funzionali, cristallografici - produzione anticorpi specifici
Produzione in vitro di trascritti (ribosonde antisenso) per ibridazioni in situ Vettore ricombinante con inserto di cDNA del gene da trascrivere + RNA polimerasi purificata (dai fagi T7 o SP6) + rNTPs (eventualmente con uno marcato radioattivamente)
Ibridazione in situ su campione intero Espressione di un gene per la crescita dei fibroblasti nell’embrione di pollo. Trascritti marcati con sonda di mRNA antisenso marcata con digossigenina e rilevati con anticorpi antidigossigenina accoppiati a fosfatasi alcalina
Studio degli effetti dell’RNA interference con produzione in vitro di trascritti antisenso RISC: RNA-induced silencing complex
ANALISI DELL’ESPRESSIONE DI UN GENE CANDIDATO Ricostruzione dell’intero cDNA attraverso ibridazioni con librerie di cDNA Sequenziamento del/i cDNA relativi al gene e confronto con il DNA genomico Inserimento cDNA in vettore di espressione Produzione del relativo mRNA e sua analisi: - analisi della localizzazione cellulare (produzione di ribosonde antisenso per ibridazione in situ in cellule o tessuti) - analisi della funzione (produzione di ribosonde antisenso per RNA interference) ed esame del cambiamento di espressione di altri geni/proteine 5) Espressione in cellule procariotiche o eucariotiche Produzione di proteina per: - studi biochimici e funzionali, cristallografici - produzione anticorpi specifici
Espressione in vitro del gene e induzione della produzione della proteina in procarioti Clonaggio di cDNA in vettori di espressione con promotori fagici molto efficienti (es: SP6 e T7) Trasformazione in cellula batterica ospite Clonaggio cDNA Il batterio deve essere di un ceppo particolare mutagenizzato: Es: ceppo lisogeno per T7 (fago T7 integrato e alterato perché ha il gene per la polimerasi T7 a valle del promotore LacZ, indotto dall’IPTG)