Le basi genetiche delle malattie Anomalie cromosomiche Malattie multifattoriali Analisi del cariotipo: Numero e struttura dei cromosomi Malattie monogeniche Analisi molecolare: Ricerca di mutazioni puntiformi nascita pubertà età adulta

ANALISI GENETICA PER LA FIBROSI CISTICA

FIBROSI CISTICA 1 2 1 2 3 4 MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA INCIDENZA 1:2500 CAUCASOIDI 1:17000 AFRICANI 1:90000 ASIATICI ITALIA 1:2600-1:3170 1 2 1 2 3 4 FREQUENZA PORTATORI CAUCASOIDI: 1/25 ITALIA: 1/27

FIBROSI CISTICA 1 2 Aa Aa 1 2 3 4 AA AA AA Aa Aa Aa aa MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA INCIDENZA 1:2500 CAUCASOIDI 1:17000 AFRICANI 1:90000 ASIATICI ITALIA 1:2600-1:3170 1 2 Aa Aa 1 2 3 4 AA AA AA Aa Aa Aa aa FREQUENZA PORTATORI CAUCASOIDI: 1/25 ITALIA: 1/27

ALTERAZIONE DI UN CANALE DEL CLORO CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) ALTERAZIONI TRASPORTO ELETTROLITICO ALTERAZIONE DELLE SECREZIONI MUCOSE INFEZIONE INFIAMMAZIONE ALTI LIVELLI DI Cl- NEL SUDORE SECREZIONI ESOCRINE MUCOSE DENSE

SECREZIONI ESOCRINE MUCOSE DENSE MALATTIA POLMONARE CRONICA OSTRUTTIVA INSUFFICIENZA PANCREATICA ESOCRINA EPATOPATIA DIABETE AZOOSPERMIA DA ATRESIA BILATERALE CONGENITA VASI DEFERENTI (CBAVD) ILEO DA MECONIO ALLA NASCITA

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

Struttura del gene CFTR Il gene è presente sul braccio lungo del cromosoma 7 E’ formato da 250 kb e 27 esoni

Proteina CFTR Formata da 1480 aminoacidi Sintetizzata sul RER e glicosilata nell’apparato di Golgi Espressa come proteina integrale di membrana nella parte apicale delle cellule epiteliali dell’intestino, delle vie aeree e delle ghiandole sudoripare, vasi deferenti Costituita da: - 6 TMD - 2 ATP binding-cassette - una regione citoplasmatica centrale (R) con funzione regolatoria

Funzioni di CFTR Membrana plasmatica Lisosomi e apparato di Golgi Attiva il canale per il cloro tramite la fosforilazione del dominio R Stimola ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel) a secernere cloro Inibisce EnaC (canale del Na+ epiteliale) riducendo il riassorbimento di sodio Regola il PH

MUTAZIONI NEL GENE CFTR 1300 mutazioni diverse http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/

Mutazioni CFTR Effetto sul fenotipo: Severe mutations F508del R117H + 5T in cis I148T + 3199del6? Mild mutations R117H I148T? Mutations of unknown significance

CORRELAZIONE GENOTIPO FENOTIPO FIBROSI CISTICA CLASSICA < 1% CFTR FIBROSI CISTICA CON 5% CFTR SUFFICIENZA PANCREATICA FORME ATIPICHE 10% CFTR

DIAGNOSI La diagnosi di malattia si basa sulla presenza di manifestazioni cliniche o biochimiche compatibili in associazione alla positività di almeno uno tra i test diagnostici validati. 1- il test del sudore (Cloro e Sodio sono aumentati nel sudore degli affetti) 2- lo studio della differenza di potenziale elettrico transepiteliale a livello delle mucose respiratorie o intestinali 3- l’analisi genetica. Per positività all’analisi genetica si intende l’identificazione di due mutazioni note per causare malattia

DIAGNOSI CF -TEST DEL SUDORE Cl- NA+ CF>60 mmol/l normale<40 mmol/l bordeline 40-60 mmol/l -TEST DELLA DIFFERENZA DI POTENZIALE ELETTRICO TRANSEPITELIALE DELLE MUCOSE RESPIRATORIO E INTESTINALI CF> 35mV normale < 20mV - TEST GENETICO 2 MUTAZIONI CF

TEST GENETICO INDIVIDUI CON SINTOMI CLINICI DI FC CONFERMA DI DIAGNOSI IDENTIFICAZIONE DELLE MUTAZIONI DEL PAZIENTE

DIAGNOSI GENETICA CF Proposta di Linee guida: Castellani et al. 2004 ANALISI DI I LIVELLO RICERCA DELLE MUTAZIONI PIU’ FREQUENTI NELLA POPOLAZIONE

MUTAZIONI CF IN ITALIA (Analisi di 3492 alleli) Mutazione % F508del 51,07 N1303K 4,84 G542X 4,84 2183AA->G 2,66 R1162X 2,42 1717-1G->A 2,11 W1282X 1,23 R553X 1,15 T338I 0,69 R347P 0,61 711+5G->A 0,57 G85E 0,40 621+1G->T 0,39 R334W 0,30 R352Q 0,24 S549N 0,24 R347H 0,18 L1077P 0,16 R1158X 0,16 541del C 0,16 R1066H 0,16 E585X 0,16 Q552X 0,14 D1152H 0,11 2790-2 A -> G 0,11 3132del TG 0,11 3667ins 4 0,11 I507del 0,10 1898+3 A->G 0,10 G1244E 0,10 1784 del G 0,10 FREQUENZA CUMULATIVA % 75,69

DF508: Mutazione CFTR più frequente 506 507 508 509 510 Ile Ile Phe Gly Val ATC ATC TTT GGT GTT ATC AT- - -T GGT GTT 3 bp delezione codone 508 (esone 10) Delezione di una Phe, ma viene conservato reading frame

La mutazione deltaF508 è presente in tutti i Paesi del continente La mutazione deltaF508 è presente in tutti i Paesi del continente. La sua frequenza varia notevolmente nelle diverse popolazioni: dal 50% degli alleli FC nell’Europa meridionale al 80% circa nelle popolazioni del Nord Europa, secondo un gradiente di frequenza decrescente da Nord verso Sud-Est.

DIAGNOSI GENETICA CF Test di I livello: ricerca delle mutazioni più frequenti nella popolazione. Consentono, quindi, l’identificazione di mutazioni note. In Italia utilizzando i kit commerciali che includano una trentina di mutazioni si ha una detection rate di circa il 75%. In queste condizioni entrambe le mutazioni possono essere identificate, e quindi consentire la diagnosi, solo in poco più della metà degli affetti; nel 37% dei casi verrà individuato un solo allele malato, addirittura nessuno in 6 affetti su 100. In realtà locali favorite da una distribuzione allelica più omogenea, e dove si possa giungere con un’analisi genetica di I livello ad una copertura del 90%, nel 18% dei pazienti verrebbe comunque identificata una sola mutazione, nessuna in un malato su 100. Pertanto, la sensibilità diagnostica di questo tipo di analisi è limitata.

METODI DI TIPIZZAZIONE MUTAZIONI NOTE presenza/assenza di un sito di restrizione ARMS ASO OLA Primer Extension (PEX)

DIAGNOSI GENETICA CF Test di II livello: “scanning” del gene volto a individuare variazioni di sequenza in definite porzioni codificanti e nelle regioni di splicing del gene CFTR. Permettono una miglior “detection rate”. Il risultato può essere di difficile interpretazione in quanto si possono individuare sia mutazioni causanti malattia che varianti fenotipicamente non patologiche (difficile precisare se si tratti di una mutazione o di una variante normale).

METODI DI SCANNING: ricerca di tutte le possibili mutazioni presenti in un frammento di DNA. sequenziamento automatico SSCP (single strand conformation polymorphism) DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) CCM (chemical cleavage of mismatch) DHPLC (denaturing high pressure liquid chromatography)

DIAGNOSI GENETICA CF Analisi di III livello: ricerca di riarrangiamenti genomici (inserzioni o delezioni nel gene CFTR). In circa il 10-15% dei soggetti affetti, dopo analisi di tutte le porzioni codificanti e regioni di splicing del gene, non si riesce ad identificare la/e mutazioni responsabili della malattia. Una ricerca estesa di riarrangiamenti in una popolazione selezionata ha consentito di individuare 16% di alleli precedentemente non identificati (Audrezet 2004). Studi preliminari su popolazione italiana sembrano confermare il dato, e sottolineare l’opportunità di considerare, in casi selezionati, questo tipo di analisi.

Audrezet 2004

DIAGNOSI GENETICA CF Possono comunque esistere forme classiche di fibrosi cistica nelle quali, anche dopo un’analisi di III livello, non viene individuato un genotipo CFTR compatibile. Si tratta di situazioni rare, che hanno fatto ipotizzare che anche in fibrosi cistica possa essere presente il fenomeno dell’eterogeneità genetica di locus, e che sottolineano come la diagnosi di malattia sia prevalentemente clinica (Groman 2003).

DIAGNOSI GENETICA CF Queste considerazioni sull’uso dell’analisi genetica per la diagnosi di fibrosi cistica si applicano alle forme classiche di malattia. Nella forme atipiche è possibile seguire un percorso analogo, rammentando che le mutazioni presenti in questi casi sono spesso diverse da quelle classiche, rappresentate nei kit convenzionali, per cui un’analisi di I livello ha sensibilità ancora minori, e che un approfondimento con scanning del gene trova spesso una specifica indicazione in questo contesto.

DIAGNOSI PRENATALE E’ preferibile utilizzare l’analisi diretta delle mutazioni presenti nella famiglia. E’ quindi giustificato, quando vi sia un progetto di gravidanza, indagare il nucleo familiare con ogni livello di analisi che possa consentire l’identificazione del genotipo completo. In alternativa, analisi di linkage con marcatori genetici

SCREENING NEONATALE Primo livello: dosaggio in tutti i neonati del tripsinogeno immunoreattivo (IRT). Secondo livello: analisi molecolare, basata su un pannello di mutazioni più rappresentate localmente . Viene eseguita nei neonati con alti valori di IRT, abitualmente superiori al 98° centile. La presenza di due mutazioni consente di porre diagnosi di malattia Terzo livello: test del sudore, qualora si individui una sola mutazione

SCREENINING NEONATALE Un effetto collaterale è l’individuazione di portatori (IRT positivo, una mutazione, test del sudore negativo) Alcuni di questi neonati sono eterozigoti composti per seconde, rare, mutazioni, e, pur negativi al test del sudore, possono risultare affetti da forme atipiche di fibrosi cistica, o comunque da patologie correlata ad anomalie del gene CFTR. Per questo, come anche per le incertezze che la comunicazione in epoca neonatale su tali mal definite patologie possono suscitare, è indicato analizzare nel secondo step dello screening neonatale solamente mutazioni note per causare forme classiche di malattia. Eventuali approfondimenti di analisi genetica vanno riservati a casi mirati, di difficile definizione diagnostica (ipertripsinemia persistente, test del sudore dubbio).

DIAGNOSI DI ETEROZIGOSI Il test genetico può essere richiesto da individui della popolazione generale, con rischio standard di eterozigosi (1/27). L’analisi genetica indicata è quella di I livello. In caso di negatività all’analisi, la probabilità di eterozigosi è intorno all’un per cento (1/105). Non è indicato un test di II livello, un’eventuale richiesta di approfondimento può essere gestita testando il partner e calcolando il rischio di coppia. Se viceversa il soggetto risultasse portatore, va proposta l’analisi del partner.

DIAGNOSI DI ETEROZIGOSI I familiari di un malato o di un eterozigote hanno una probabilità maggiore di essere portatori. In questo contesto è essenziale conoscere la mutazione che interessa il ramo familiare a cui appartiene chi richiede l’analisi. Al fine di individuare tale mutazione è giustificato, previo informato consenso dell’interessato, approfondire quando necessario con accertamenti di II od eventualmente anche III livello il genotipo dell’affetto o del genitore dell’affetto parente del consultando.

In breve: · Analisi di I livello: kit, commerciale o home-made, che includa le più frequenti mutazioni dell’area di riferimento del laboratorio. Analisi di II livello: scanning di tutti gli esoni e regioni limitrofe. Analisi di III livello: ricerca delezioni e/o inserzioni. · Il test del sudore, e non l’analisi genetica, è il goldstandard per la diagnosi di malattia. Se il test del sudore non è eseguibile o risolutivo, un’analisi genetica di I livello, ed eventualmente su giudizio clinico di II o III livello possono essere indicate. · Il testing fetale è da scoraggiare e va sostituito con la ricerca di mutazioni sulla coppia · L’utilizzo di analisi genetica di I livello può essere integrato nello screening neonatale di malattia. · La probabilità individuale di eterozigosi può essere efficacemente calcolata con un test di I livello, o, in caso di familiarità, con ricerca della mutazione specifica. Non è indicato un test di II livello. · Il rischio riproduttivo di coppia è di solito significativamente ridotto dai test di I livello. L’approfondimento con test di II livello è possibile in una minoranza di casi, e deve sempre essere preventivamente discusso con la coppia in sede di consulenza genetica.

COREA DI HUNTINGTON

COREA DI HUNTINGTON -Autosomica Dominante - Penetranza dipendente dall’età - 50% si ammalano entro 45 anni

HUNTINGTONINA

COREA DI HUNTINGTON

Le malattie da espansioni poliglutaminiche

Correlazione tra eta’ di insorgenza e numero di ripetizioni COREA DI HUNTINGTON Correlazione tra eta’ di insorgenza e numero di ripetizioni

COREA DI HUNTINGTON: anticipazione

DIAGNOSI PREDITTIVA PROBLEMI ETICI

PRINCIPI GENERALI Consenso Informato Scelta Informata Autonomia - Confidenzialità

Diagnosi delle sindromi da espansioni poliglutaminiche con la PCR Alleli mutanti Alleli normali