DNA Fingerprinting LLC Bologna - 2009

Prerequisiti Per affrontare questa attività bisogna conoscere: La struttura del DNA I plasmidi Gli enzimi di restrizione

Obiettivo Confrontare le dimensioni dei frammenti del DNA generati dalla digestione enzimatica, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli organismi.

Introduzione Per stimolare l’interesse viene riprodotta un’indagine poliziesca, dove il materiale biologico rinvenuto sul luogo del delitto viene analizzato e comparato con quello appartenente ad alcuni individui sospetti, fra i quali lo studente dovrà individuare il profilo genetico corrispondente al colpevole. In questa esperienza, condotta a scopo didattico, si utilizza DNA plasmidico, quale fonte di materiale da analizzare in quantità tale da consentire una visualizzazione diretta, mentre nella realtà è necessaria una preventiva amplificazione del DNA per ottenere risultati osservabili e significativi (PCR)

La prova è eseguita su piccola scala per motivi tecnici, ma i principi richiamati come pure i passaggi (digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e colorazione delle bande di DNA) sono gli stessi richiesti dalla conduzione dell’esperimento a livello professionale. La produzione dei frammenti di DNA avviene durante il trattamento con gli enzimi di restrizione, che sono in grado di tagliare l’acido nucleico in prossimità di sequenze nucleotidiche specifiche.

La tecnica elettroforetica è poi fondamentale per separare i frammenti neoformati. Nelle celle elettroforetiche si genera un campo elettrico nel quale il DNA, carico negativamente, migra verso il polo positivo. La matrice (nel nostro caso agarosio), nella quale si muove il DNA, è quella che materialmente consente la separazione dei frammenti generati dalla digestione: infatti la concentrazione dell’agarosio(0,8%) conferisce al gel una porosità idonea ad ottenere la risoluzione desiderata (adeguata separazione delle bande). Il gel dopo l’elettroforesi viene colorato per osservare i frammenti evidenziati in forma di bande.

DNA utilizzato in questo esperimento

Tecnica del DNA fingerprinting Digestione Elettroforesi Colorazione

Digestione

Digestione

Digestione

Digestione

Digestione

.                                  Preparazione Gel di agarosio

Elettroforesi LLC Bologna - 2009

Elettroforesi

Caricamento

Corsa elettroforetica

Colorazione

Colorazione

Colorazione - C 1 2 3 +

Chi è il colpevole ? C 1 2 3

Chi è il colpevole ? C 1 2 3 4

Chi è il colpevole? C 1 2 3 C 1 2 3 C 1 2 3 C 1 2 3

Esempio di Profilo Genetico MARCATORE Profilo D8S1179 10-10 D21S11 29-30 D7S820 9-12 CSF1PO 12-13 D3S1358 16-17 TH01 6-9.3 D13S317 8-12 D16S539 vWA 17-17 TPOX 7-8 D18S51 14-14 D5S818 11-11 FGA 23.2-24 PentaE 7-13 PentaD 10-12 Sex F

Fonti di materiale biologico Sangue Liquido Seminale Saliva Urina Capelli Denti Ossa Tessuti Sudore Solo una piccola quantità di sangue è necessaria per ottenere un profilo genetico.

DNA: presente in ogni materiale cellulare che contiene un nucleo

Analisi forense del DNA Raccolta del campione (scena del crimine/campioni di confronto) Valutazione del tipo di traccia diagnosi generica Estrazione e purificazione del DNA Quantificazione del DNA Amplificazione e corsa su elettroforesi capillare Interpretazione del profilo genetico

Polimorfismi STR

Elettroforesi capillare + Laser

Elettroforesi capillare + Laser

Elettroforesi capillare + Laser

Elettroforesi capillare + Laser

Elettroforesi capillare Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi.

Regioni polimorfiche del DNA non codificanti Regioni non codificanti del DNA sono poco presenti nel DNA dei procarioti.Tra gli eucarioti, con l’incremento della complessità dell’individuo aumenta anche la quantità di DNA non codificante.

Le regioni polimorfiche del DNA Il confronto tra DNA diversi avviene studiando alcune zone ad alta variabilità e quindi caratteristiche, nel loro insieme, di un singolo individuo. REGIONI POLIMORFICHE del DNA costituiscono l’impronta digitale molecolare di ogni persona (Fingerprint).

Variable Number of Tandem Repeat Tipi di Polimorfismo per fingerprinting Microsatellite Short Tandem Repeat STR Minisatellite Variable Number of Tandem Repeat VNTR Subtelomeriche Ripetizione: 8-80 bp Lunghezza totale 0.5-30Kb Disperse in tutto il genoma Ripetizione: 2-7 bp = AATG

Tipizzazione individui AATG AATG AATG AATG 4 ripetizioni AATG AATG AATG AATG 4 ripetizioni

Tipizzazione individui Gli amplificati hanno le stesse dimensioni 4

Tipizzazione individui AATG AATG AATG AATG 4 ripetizioni AATG AATG AATG 3 ripetizioni

Tipizzazione individui Gli amplificati hanno dimensioni diverse 3 4

L’individuo in esame avrà il seguente profilo genotipico: Locus TPOX Locus CSF1PO Locus TH01 (4 ; 4) (4 ; 5) (8 ; 3) L’individuo in esame avrà il seguente profilo genotipico: Locus TPOX (4 ; 5) Locus CSF1PO (8 ; 3) Locus TH01 (4 ; 4) R.I.S.

Marcatori STR utilizzati in ambito forense

Esempio di Profilo Genetico MARCATORE Profilo D8S1179 10-10 D21S11 29-30 D7S820 9-12 CSF1PO 12-13 D3S1358 16-17 TH01 6-9.3 D13S317 8-12 D16S539 vWA 17-17 TPOX 7-8 D18S51 14-14 D5S818 11-11 FGA 23.2-24 PentaE 7-13 PentaD 10-12 Sex F

Utilizzi DNA fingerprinting Casi criminali: indagato/vittima-traccia Test di paternità: paternità controversa Immigrazione: relazioni familiari Mass disaster Soggetti scomparsi Identificazione Identificazioni storiche

Casi criminali: indagato/vittima-traccia Il DNA incastra due volte il romeno accusato dello stupro di San Valentino Nuovi esami confermano: Gavrila fu l'autore di un'analoga violenza al Pigneto nel luglio 2008 Corriere della sera 6 aprile 2009 Usa, salvo grazie al test del Dna Repubblica — 25 agosto 2001   pagina 17   sezione: POLITICA ESTERA WASHINGTON - La prova del Dna ha salvato dalla condanna a morte un americano in carcere da diciassette anni. Nel 1982 Charles Fain venne condannato alla sedia elettrica per aver stuprato e ucciso una bambina di nove anni. Al processo, il medico legale, sostenne che i peli ritrovati sul corpo della bambina erano di Fain. Oggi la prova del Dna ha dimostrato che si sbagliava. «Ringrazio Dio per il Dna» ha detto l' ex condannato appena liberato. «Sapevo», ha aggiunto, «che prima o poi tutta questa storia sarebbe finita bene».

Accertamenti di paternità                                                    

Esempio di test di paternità PRESUNTO PADRE FIGLIO MADRE

Utilizzi Dna fingerprinting Captured December 13, 2003 Uday and Qusay Hussein Killed July 22, 2003 Questo uomo è realmente Sadaam Hussein? Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Box 23.1, p. 534

Identificazioni storiche Il mistero di Anastasia Romanov e di Anna Anderson