EFFETTO SINERGICO DELLA GLIADINA E BIOTECNOLOGIE GENOMICHE, INDUSTRIALI ED AMBIENTALI Corso di laurea magistrale EFFETTO SINERGICO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi sperimentale Relatore: Candidata: prof. Massimo Reverberi Chiara Guarino anno accademico 2014/2015

LA SINDROME CELIACA L’unica cura è l’aderenza ad una La celiachia è un’enteropatia autoimmune scatenata dalla gliadina, sostanza lipoproteica presente in alcuni cereali (grano, segale, orzo e avena), in soggetti geneticamente predisposti. atrofia dei villi intestinali; malassorbimento; diarrea; • anemia; • osteoporosi; • perdita di peso • dermatiti L’unica cura è l’aderenza ad una dieta priva di glutine (es. riso, mais). EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

LA SINDROME CELIACA Batteri patogeni Virus intestinali (rotavirus) Catassi, C.,et al (2014) Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition 59, 7-9. Virus intestinali (rotavirus) Batteri patogeni Contaminanti alimentari (micotossine) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

LE MICOTOSSINE contaminazione indiretta contaminazione diretta Le micotossine sono prodotte dal metabolismo secondario di alcune specie fungine (aflatossine, fumonisine, tricoteceni). contaminazione indiretta contaminazione diretta CARCEROGENE EPATOTOSSICHE NEFROTOSSICHE ESTROGENICHE Reg. (UE) N. 165/2010 Reg. (CE) 1126/2007 Reg.(CE) n. 1881/2006 EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

MICOTOSSINE e CELIACHIA: il Deossinivalenolo Il deossinivalenolo (DON) è una micotossina appartenente al gruppo dei tricoteceni prodotta da alcune specie di Fusarium e particolarmente diffusa nei cereali quali grano, orzo e mais. Provoca vomito, dissenteria ed immunodepressione. Effetti del DON sulla permeabilità dell’epitelio intestinale*. Consumi medi di pane e pasta ed esposizione al DON (fino al 46,1 % per gli adulti e al 95,9 % del TDI per i bambini).** *Maresca M., Fantini J. (2010) Toxicon 56, 282–294. ** Scientific Cooperation (SCOOP) 3.2.10, Brussels, Belgium, 2003. Ruolo nell’eziologia e nella persistenza della celiachia EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

Ruolo del DON nella sindrome celiaca SCOPO DELLA TESI Ruolo del DON nella sindrome celiaca Cellule Caco-2 umane trattate con gliadina digerita e DON Valutazione degli effetti citotossici (MTT test); Studi di permeabilità cellulare (spettrometria di massa); Analisi della risposta infiammatoria (western blot, ELISA). EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

EFFETTO CITOTOSSICO DELLA GLIADINA CTRL (PBS) 50 mg di gliadina digerita per 6h 50 mg di gliadina digerita per 12 h 50 mg per 6h EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

EFFETTO CITOTOSSICO DEL DON CTRL (PBS) 100 ng/mL di DON per 12 h 5, 50, 100 ng/mL per 12h EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

EFFETTO CITOTOSSICO SINERGICO CTRL (PBS) 100 ng/mL di DON per 12 h 100ng/ml di DON + gliadina (50ug) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

PERMEABILITA’ CELLULARE Metodo analitico basato sulla spettrometria di massa tandem Ione molecolare Ione genitore (m/z) Ione figlio (m/z) Energia di collisione (eV) [M+H]- 295,0 265,0 10 138,0 15 HPLC-UV EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

PERMEABILITA’ CELLULARE EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RISPOSTA INFIAMMATORIA (COX-2) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-6) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-8) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

CONCLUSIONI Si verifica un effetto citotossico sinergico della gliadina e del DON; L’assorbimento del DON è minore in presenza della gliadina; Il DON causa l’over-espressione di COX-2, Il-6 e Il-8 al pari o in maggior misura della sola gliadina. Si verifica un aumento della risposta infiammatoria dovuto alla co-presenza della gliadina e del DON. Il DON può attivare uno stato infiammatorio tale da alterare la funzionalità intestinale e causare l’insorgere della sindrome celiaca in individui predisposti. Il DON può peggiorare lo stato infiammatorio acuto dovuto alla sindrome celiaca, e può quindi influenzare la persistenza della patologia. EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

Reale effetto tossicologico causato dal DON presente negli alimenti? PROSPETTIVE FUTURE Reale effetto tossicologico causato dal DON presente negli alimenti? Particolari categorie di consumatori che presentano una compromessa funzionalità intestinale e/o una dieta poco varia (celiaci). Consumatori caratterizzati da un basso peso corporeo (primissima infanzia) ai quali vengono erroneamente proposti alimenti per adulti, sia gluten-free che glutinati, contenenti tenori maggiori di micotossine. Co-presenza di altre micotossine (fumonisine, aflatossine, T2, HT2, ZEA,…). EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RINGRAZIAMENTI EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

GRAZIE PER L’ATTENZIONE Chiunque sia stato stato il padre di una malattia, un’alimentazione non corretta ne è stata la madre. (cit. George Herbert) “Il pranzo” di Diego Velázquez (1617). Museo dell'Ermitage di San Pietroburgo. EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

PERMEABILITA’ CELLULARE Validazione del metodo analitico basato sulla spettrometria di massa tandem ng/mL Recupero (%) RSDr (%) (n=6) 5 91 ≤2 50 98 ≤1 100 97 ≤3 LOD LOQ 0,1 ng/mL 1 ng/mL EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RISPOSTA INFIAMMATORIA (COX-2) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-6) La scelta è ricaduta proprio su queste interleuchine poiché alcuni studi riportano che esse vengono prodotte dalle cellule Caco-2 o dalle cellule dendritiche se stressate con gliadina e sono over-espressi in vivo nei soggetti celiaci che assumono glutine. L'IL-6 è un'interleuchina che agisce come citochina pro-infiammatoria, secreta dai Linfociti T e dai macrofagi per stimolare la risposta immunitaria, ad esempio durante un'infezione o in seguito ad un trauma come una scottatura o altri danni tissutali che portino ad infiammazione. E’ considerata un importantissimo indice di patologie infiammatorie croniche dell'intestino. EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-8) L'IL-8 induce chemotassi delle cellule bersaglio, in primo luogo neutrofili ma anche altri granulociti, che in questo modo migrano verso il sito di infezione. L'interleuchina-8 è spesso associata ad infiammazione ed a stress ossidativo. EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015