Applicazioni: 1- la variabilità genetica nelle scienze forensi Le scienze forensi hanno la funzione di aiutare i giudici e le giurie nel prendere delle decisioni per risolvere questioni legali, siano esse legate a crimini o controversie civili. La genetica forense è una delle discipline delle scienze forensi. L’importanza della genetica nelle scienze forensi si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie alla evoluzione dei marcatori genetici polimorfici e degli strumenti utilizzati

Variabilità genetica nelle scienze forensi A cosa serve? Identificare individui che hanno commesso dei crimini Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Asiatico ecc.) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore capelli) Identificare le vittime nei disastri di massa (disastri aerei, genocidi, ecc.) Risolvere casi di paternità incerta Identificazione di droghe Identificazione di DNA appartenente a specie a rischio di estinzione in crimini legati al loro contrabbando

Variabilità genetica nelle scienze forensi Il primo caso: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo. 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting rivelò successivamente che egli era innocente. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dell’assassino. 1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchford, gli aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di denaro. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.

Variabilità genetica nelle scienze forensi Probabilità di match con sonda multilocus = 3 X 10-11 Il DNA fingerprinting Introdotto da Alec Jeffreys nel 1975 Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus “core” minisatellite marcata con radioattivo per l’ibridazione. Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X

“Evoluzione” dei marcatori utilizzati nella genetica forense 1986. Il primo marcatore utilizzato per fini forensi è stato il DNA fingerprinting, basato su sonde multilocus per minisatelliti (Pitchfork) Vengono introdotte le sonde per singoli loci minisatelliti (SLP), si ha il vantaggio di poter trattare da un punto di vista statistico i dati (“probabilità di match”) 1988. Primo kit commerciale per l’individuazione di SNPs tramite PCR (sistema HLA), si ha il vantaggio di poter analizzare frammenti degradati e/o in scarsa quantità Primi anni ’90. Vengono utilizzati i microsatelliti: elevata eterozigosità, PCR, vantaggi per la trattazione statistica. 1992. mtDNA: elevata variabilità di sequenza, tipizzazione possibile anche su quantità minime di DNA 1992. primo STR del cromosoma Y: campioni misti uomo/donna ecc.

Autosomi Cromosoma Y mtDNA Marcatori autosomici, del mtDNA e del cromosoma Y: vantaggi e svantaggi nelle scienze forensi Autosomi Cromosoma Y mtDNA

Generare un profilo STR 1. Estrarre e purificare il DNA Contenuto in DNA dei campioni biologici: Tipo di campione Quantità di DNA Sangue 30,000 ng/mL macchia 1 cm2 200 ng macchia 1 mm2 2 ng Liquido seminale 250,000 ng/mL tampone vaginale postcoitale 0 - 3,000 ng Capelli Capello strappato Capello perso 1 - 750 ng/capello 1 - 12 ng/capello Saliva Urine 5,000 ng/mL 1 - 20 ng/mL

Generare un profilo STR: 2. PCR Amplificare tramite PCR più microsatelliti (multiplex) utilizzando primers fiancheggianti Primers marcati con fluorocromi differenti per differenti gruppi di STRs

Generare un profilo STR: 3 Generare un profilo STR: 3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare: ABI 310

Generare un profilo STR: 3. seq. mediante elettroforesi capillare: Prodotto PCR iniettato nella colonna Si applica corrente elettrica Il DNA si muove vero il polo positivo Il DNA viene separato in base alla sua lunghezza: Detector Window Il colore del prodotto PCR viene registrato quando passa nel detector

Generare un profilo STR: 4 Generare un profilo STR: 4. interpretazione dei dati del sequenziamento: dati grezzi

RAW DATA PROCESSED DATA D3 vWA FGA D8 D21 D18 D5 D13 D7 Am Il software GENESCAN divide I dati grezzi in un elettroferogramma separato per ciascun colore Blue Green Yellow Red RAW DATA Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare D3 vWA FGA D8 D21 D18 D5 D13 D7 Am PROCESSED DATA

La probabilità di match: “la regola del prodotto” Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di DNA ed un sospetto è quantificato tramite la “probabilità di match”: Ovvero: qual’è la probabilità che un profilo come quello creato a partire dal materiale biologico rinvenuto corrisponda ad un individuo della popolazione? Si applica la regola statistica del prodotto per eventi indipendenti

La regola del prodotto 0.222 x 0.222 x 2 = 0.1

Probabilità di match: la regola del prodotto 1 in 10 1 in 22,200 x 1 in 111 1 in 20 1 in 100 1 in 14 1 in 81 1 in 113,400 x 1 in 116 1 in 17 1 in 16 1 in 31,552 x 1 in 79,531,528,960,000,000

Contenuto in DNA dei campioni biologici: Tipo di campione Quantità di DNA Sangue 30,000 ng/mL macchia 1 cm2 200 ng machia 1 mm2 2 ng Liquido seminale 250,000 ng/mL tampone vaginale postcoitale 0 - 3,000 ng Capelli Capello strappato Capello perso 1 - 750 ng/capello 1 - 12 ng/capello Saliva Urine 5,000 ng/mL 1 - 20 ng/mL

Il massacro di Srebrenica Le forze serbe conquistano Srebrenica Vengono massacrati numerosi Bosniaci mussulmani Si perdono le tracce di 30000 persone

Il massacro di Srebrenica Viene raccolto il sangue dei parenti delle persone scomparse Vengono sequenziati la regione di controllo del DNA mitocondriale ed alcuni STR autosomici Viene estratto il DNA dai resti delle vittime non identificate Viene analizzato il DNA nucleare per I resti meglio conservati ed il mtDNA nei casi più degradati Il confronto dei profili del DNA dei parenti con quello delle vittime permette di riconoscere l’identita di numerose vittime

Il progetto ha generato Identificazione delle persone disperse nel World trade center in seguito ad attacco terroristico del 9/11 Il progetto ha generato 52,000 profili STR 44,000 profili mtDNA 17,000 profili SNPs 850 delle 1594 vittime identificate grazie all’analisi del DNA

Il caso dell’albero testimone 3 maggio 1992, Phoenix, AZ Una donna viene ritrovata morta per strangolamento nelle vicinanze di alberi di Cercidium floridum. Nel camion di un sospetto vengono rinvenuti dei frutti di Cercidium floridum. La specie in questione presenta una notevole variabilità di sequenza L’analisi del DNA (mediante analisi RAPD-random amplified polymorphic DNA) permette di stabilire che i frutti appartengono ad uno degli alberi che si trovano sulla scena del delitto Il profilo RAPD non corrisponde a nessuno degli alberi della stessa specie analizzati per confronto Il sospetto viene incriminato

La tecnica RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA Si utilizzano dei primers corti (10 basi) che hanno una elevata probabilità di appaiarsi a più regioni del genoma e quindi producono una serie di amplificati che possono poi essere analizzati mediante separazione su gel di agarosio. Generalmente utilizzati quando non si ha a disposizione la sequenza del DNA di una certa specie, oppure non se ne conoscono siti variabili

Il gatto palla di neve 3 ottobre 1994, Prince Edward Island, Canada Scompare una donna di 32 anni, successivamente ritrovata morta. Nella sua macchina abbandonata vengono ritrovate tracce del suo sangue assieme ai peli di un gatto L’ex marito della vittima, tra i sospettati, vive con un gatto di nome palla di neve Il DNA estratto dai peli di palla di neve presenta un profilo DNA uguale a quello ottenuto dai peli ritrovati nella macchina della vittima. L’ex marito viene incriminato

Regola del prodotto non sempre valida (parenti) Problemi per l’utilizzazione dei marcatori polimorfici in ambito forense Degradazione Drop out allelico Falsi picchi Regola del prodotto non sempre valida (parenti)

Problemi: Dropout allelico 1500 Campione di riferimento Campione da analizzare 150 ? Quando il DNA estratto è molto scarso o fortemente degradato si può verificare che uno solo dei due alleli ad un locus venga amplificato. Nella figura l’allele 14 al sito D13S317 non si è amplificato: Falso omozigote 8/8, in realtà eterozigote 8/14

Problemi: falsi picchi Negli elettroferogrammi possono presentarsi dei falsi picchi dovuti a problemi tecnici e/o biologici. Questi picchi possono essere interpretati erroneamente come alleli

Problemi: La regola del prodotto non considera la possibilità che il colpevole sia un parente del sospettato Se il colpevole è un parente del sospettato, la regola del prodotto per calcolare la probabilità di match non è più valida, in quanto i due condivideranno diversi alleli uguali per discendenza.