Aspetti microbiologici: dalla raccolta dei campioni all’interpretazione critica dei risultati 24 Novembre 2010 dott.ssa Claudia Venturelli

obiettivi RICERCA ED ERADICAZIONE DELL’AGENTE INFETTIVO IDENTIFICAZIONE DELLA PROBABILE FONTE D’ INFEZIONE: • Respiratoria • Addominale • Cutanea • Vie urinarie • SNC • Protesi e cateteri

La Diagnosi Colture appropriate devono essere sempre ottenute prima di iniziare la terapia antibiotica. Per ottimizzare l'identificazione degli organismi che causano l'infezione, devono essere prelevate almeno due emocolture di cui una per via percutanea ed una prelevata attraverso ciascun catetere vascolare, a meno che il catetere non sia stato introdotto di recente (< 48 ore). E’ raccomandato il prelievo prima della terapia antibiotica e secondo quanto richiesto dalla clinica, di colture da altri siti come urina, fluido cerebrospinale, ferite, secrezioni delle vie respiratorie o altri fluidi corporei.

La terapia antibiotica La terapia antibiotica deve essere iniziata possibilmente entro la prima ora dal riconoscimento della sepsi grave, dopo il prelievo delle colture appropriate.

La terapia antibiotica Il regime antimicrobico iniziale deve sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore sulla base dei dati microbiologici e clinici, con lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più stretto per limitare lo sviluppo di resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i costi. (DE-ESCALATION)

Il controllo del focus infettivo In ogni paziente con sepsi grave si deve valutare se è presente un focus infettivo sensibile alle misure di controllo, nello specifico il drenaggio di un ascesso o di un focus locale di infezione, l'asportazione di tessuto necrotico infetto, la rimozione di un presidio potenzialmente infetto o del controllo definitivo di un focus che si sta infettando per contaminazione microbica .

Sepsis resuscitation bundle 0-6 ore Sepsis management bundle Bundle (fascio/pacchetto): a. insieme di interventi applicati ad un processo morboso che, se usati contemporaneamente, danno un outcome migliore rispetto alla applicazione individuale. Sepsis resuscitation bundle 0-6 ore Sepsis management bundle entro 24 ore

Non appena il paziente avverte il brivido e /o segni e sintomi di febbre La rapidità di esecuzione in rapporto all’evento cruciale , perché … La batteriemia è nella maggior parte dei casi un evento acuto e fuggevole La clearance microbica è molto rapida Il picco febbrile segue la poussee batteriemica di 30-60 min.

Quanti prelievi effettuare ? Effettuare almeno 2 prelievi : 1 da vena periferica 1 da CVC Paralleli = Allo stesso tempo Non scartare la prima quantità di sangue prelevato perché è quella con la più alta concentrazione di microbi Contraddistinguere ciascun prelievo con l’etichetta corrispondente alla modalità di prelievo. Indicare su ciascun prelievo l’ora

CVC Vena Periferica Vena Periferica CVC

Modalità di prenotazione in delle emocolture parallele e seriate Hospital Web delle emocolture parallele e seriate

Cosa fare nel caso di cateteri a due vie ? Nel caso di cateteri a piu’ lumi (ramo bianco e rosso) eseguire 3 prelievi: 1 da vena periferica 1 dal lume rosso 1 dal lume bianco Tutti allo stesso tempo Ricordarsi di applicare le corrispondenti etichette correttamente ed indicare il tipo di lume sul flacone

Come conservare e inviare i flaconi alla Microbiologia ? I flaconi, tenuti a temperatura ambiente, dovrebbero pervenire alla Microbiologia il prima possibile ed essere posti immediatamente negli appositi incubatori

L’emocoltura deve essere ripetuta nei giorni successivi ? No. Non ci sono indicazioni per il prelievo nei giorni successivi per il follow up, perché quest’ultimo si basa sui dati clinici. Ci sono due eccezioni: - l’endocardite (la persistenza dell’infezione può richiedere una modifica della terapia) - le sepsi da S. aureus in cui il prelievo dopo 2 e 4 giorni può fornire utili indicazioni di complicanze infettive insorte per via ematogena (es. endocardite o osteomielite) o per estensione dell’infezione in altre sedi (tromboflebite settica, ascessi).

Non eseguire colture di routine dei cateteri rimossi da pazienti in unita intensiva. Analizzare microbiologicamente solo quei cateteri sospettati di essere la fonte dell’infezione o la causa della sepsi Infatti fino al 20% dei cateteri venosi centrali sono colonizzati alla rimozione; la maggior parte non sono associati con infezioni locali o batteriemie/fungemie. Questo sottoporrebbe a lavoro inutile e al rischio di terapie antibiotiche inappropriate

LIQUIDI BIOLOGICI (peritoneale, ascitico, biliare) Eseguire il prelievo prima della terapia antibiotica CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA ASPIRAZIONE PERCUTANEA 1. Pulire il sito della puntura con alcool e antisepsi del sito di aspirazione. 2. Aspirare in asepsi il campione di liquido necessario con siringa e ago sterili. 3. Introdurre immediatamente una parte di liquido nei flaconi per aerobi ed anaerobi. 4.Un prelievo Adeguato è costituito da almeno 0,5 cc di fluido o tessuto trasportato al laboratorio per la ricerca degli anaerobi CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA TUBI DI DRENAGGIO La raccolta di liquidi da drenaggio deve essere scoraggiata in favore di una diretta aspirazione dall’area drenante Disinfettare il tubo con una soluzione disinfettante, lasciare asciugare ed aspirare il liquido. Introdurre il campione nei contenitori sterili come da protocollo di laboratorio. La coltura di fluidi da drenaggi posizionati da piu’ di 2 giorni potrebbe non essere attendibile. TRASPORTO DEL CAMPIONE Inviare in laboratorio quanto prima possibile. Non refrigerare.

Sepsi addominali: quando e quali colture? Si raccomanda l’esecuzione di un solo prelievo in quantità sufficiente da inviare in microbiologia per la ricerca degli anaerobi ed aerobi in apposito terreno di trasporto Il tampone non costituisce un idoneo campione per la ricerca degli anaerobi SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003; 37: 997-1005

Sepsi addominali: quando e quali colture? I prelievi dai drenaggi addominali possono condurre a risultati errati per la contaminazione della porzione distale del drenaggio, con conseguente copertura antibiotica non necessaria SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003; 37: 997-1005

Ascessi ed essudati da ferita chirurgica INDICAZIONI GENERALI Raccogliere i campioni preferibilmente prima di iniziare la terapia antibiotica Pulire la cute circostante con soluzione fisiologica sterile.Per ferite chiuse e aspirati: Antisepsi della cute con soluzione di clorexidina 2% o alcool 75% . Per ferite aperte: prelevare un frammento lavando con soluzione fisiologica sterile prima della raccolta. Prelevare tessuto infetto piuttosto che un frammento superficiale. Evitare la raccolta con tampone per la scarsa significatività, se è possibile eseguire un aspirato o un prelievo bioptico. CONTENITORI: Flaconi per aerobi e anaerobi

TECNICA DI RACCOLTA Ascessi chiusi: Aspirare il materiale infetto con ago e siringa, inserire l’ago nel tessuto in varie direzioni (se possibile). Se l’aspirazione non porta alla raccolta del campione, si può valutare l’opportunità di iniettare nel sottocute della soluzione salina sterile e aspirare nuovamente. Inoculare il contenuto nei flaconi sterili per aerobi e anaerobi Pus: Aspirare la porzione profonda della lesione o l’essudato, con siringa e ago sterili. Inviare come per ascessi chiusi. Tessuti e campioni bioptici: Raccogliere una quantità sufficiente di tessuto evitando le aree necrotiche. Raccogliere i frammenti di tessuto piccoli nel flacone per aerobi e per anaerobi

Utilizzare i tamponi solo se non può essere ottenuto tessuto o aspirato Per i prelievi da ferita :Rimuovere i frammenti superficiali tramite irrigazione e pulire con soluzione salina sterile; se la ferita è asciutta raccogliere due campioni imbevuti di soluzione salina sterile; ruotare delicatamente il tampone sulla superficie della ferita per 5 volte, specialmente dove c’è pus o nelle aree infiammate TRASPORTO DEL CAMPIONE Non refrigerare o incubare prima o durante il trasporto. Se non è possibile inviare subito il campione al laboratorio, mantenerlo a temperatura ambiente. Consegnare gli aspirati ed i tessuti al laboratorio entro 30 minuti e comunque il prima possibile

Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi : prelievo con siringa

Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi con tampone

Nuovi scenari nella diagnosi microbiologica di sepsi

Current Sepsis Test Providers Company Product Name Main Method Blood prep Method Detection Pathogens Detection Method Test Times Seegene Seeplex® Sepsis Test Multiplex PCR Whole blood No culture 54 Bacteria 6 Fungi (Resistances: 3) Automated CE or Agarose 4 - 6 hr Roche SeptiFast Real-time PCR (column) 19 bacteria 6 fungi (Resistances :1) Real-Time (melting curve) 6 hr BAG Health Care Hyplex® Blood Screen Multiplex-PCR -ELISA Blood culture 10 bacteria (Resistances :1) ELISA 4.5 - 6 hr SIRS LAB VYOO™ LOOXSTER® 34 bacteria 6 fungi (Resistances :5) Gel Chip sequencing Molzym SepsiTest™ Blood qPCR MolYsis 28 bacteria 5 fungi Sequencing BACTfish BACTfish™ Sepsis kit in situ Hybridization 9 bacteria 3 fungi Fluorescent microscope 1 hr Mobidiag Sepsis ProveIt™ Lab-on-chip 13 bacteria chip 3 hr

Il regime antimicrobico iniziale dovrebbe sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore sulla base dei dati microbiologici e clinici, con lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più stretto per limitare lo sviluppo di resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i costi. Grado E

quale farmaco utilizzare ? MIC = misura della attività antimicrobica “in vitro” Utilità per il clinico Valutazione comparativa della possibile efficacia “in vivo” quale farmaco utilizzare ?

Pseudomonas aeruginosa Interpretazione MIC (mg/L) Ceftazidime S 4 Imipenem 1 Piperacillina 32 Ciprofloxacina R 8 Gentamicina 2 Tobramicina Amikacina

Pseudomonas aeruginosa 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 0.5 | 1| 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 0.5 | 1 | 2 | 4 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Piperacillina Ceftazidime Cefepime Imipenem Meropenem Aztreonam Gentamicina Tobramicina Amikacina Ciprofloxacina Levofloxacina S S S R

Pseudomonas aeruginosa MIC (mg/L) Interpretazione Range MIC= S Ceftazidime 4 S < 1 - 8 Imipenem 1 < 0.5 - 4 Piperacillina 32 < 0.5 - 64 Ciprofloxacina 8 R < 0.25 - 4 Gentamicina 2 Tobramicina Amikacina < 0.5 - 16

Trend % I/R Escherichia coli 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND ESBL

Trend % I/R P.aeruginosa 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

Trend % I/R Klebsiella pneumoniae 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

Produzione di ESBL (CTX-M-15) +  OMP K36 2007-2008: Klebsiella pneumoniae da vari ospedali ERT Ampicillina > 16 Amoxi/Clav > 16 Pip/Tazo > 64 Cefotaxime > 16 Ceftazidime > 32 Cefepime > 16 Aztreonam > 16 Imipenem 1-2 Meropenem 2-4 Ertapenem > 8 Tigeciclina 1-2 Colistina < 1 Isolato produttore di ESBL IMI MEM Diffusione clonale Amikacina > 32 Gentamicina > 8 Tobramicina > 8 TMP/SXT > 2 Ciprofloxacina > 32 Levofloxacina > 32 D’Andrea et al., 19th ECCMID 74

Resistenza emergente ai carbapenemi nelle Enterobacteriaceae Produzione di metallo-b-lattamasi (VIM, IMP) ESBL o produzione di AmpC + perdita di porine Produzione di carbapenemasi a serina (KPC, SME, IMI) 89 Klebsiella spp. 59 Enterobacter spp. (isolati non sensibili ai carbapenemi) Woodford et al., JAC 2007; 50:582 Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi EARSS 2008 75 75

METALLO-BETA-LATTAMASI: UN PROBLEMA GLOBALE P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae VIM-1 a 18 IMP-1 a 23 SPM-1 P. aeruginosa GIM-1 P. aeruginosa AIM-1 P. aeruginosa SIM-1 Acinetobacter KHM-1 Citrobacter freundii 77 77

EMERGENZA DI KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUTTORE DI KPC IN ITALIA Gioconda Brigante1, Silvia Bracco1, Marco Maria D’Andrea2, Tommaso Giani2, Nicoletta Corbo1, Mario Tavola3, Gian Maria Rossolini2, Francesco Luzzaro1 1Laboratorio di Microbiologia e Virologia, Ospedale A. Manzoni, Lecco 2Dipartimento di Biologia Molecolare, Sezione di Microbiologia, Università di Siena 3Unità di Terapia Intensiva, Ospedale A. Manzoni, Lecco AMCLI 2009 Tra maggio e giugno 2009, Klebsiella pneumoniae produttore di KPC-2 è stata riscontrata in 3 pazienti ricoverati presso la Terapia Intensiva dell’Ospedale A. Manzoni (Lecco). Gli isolati erano caratterizzati da resistenza ad alto livello verso cefalosporine, fluorochinoloni e piperacillina-tazobactam, mentre gentamicina (MIC, 2 mg/L), tigeciclina (MIC, 2 mg/L) e colistina (MIC, 0.5 mg/L) mantenevano la loro attività. Per quanto riguarda i carbapenemi, gli isolati presentavano MIC elevate (> 1 mg/L) per tutte le molecole testate (ertapenem, imipenem e meropenem) e test di Hodge positivo, indicando la possibile produzione di carbapenemasi. La presenza di enzimi di tipo KPC è stata sospettata sulla base dei risultati dei test di conferma fenotipici (test di sinergia con EDTA negativo, test di inibizione con acido boronico positivo) e definitivamente confermata mediante sequenziamento genico.

Suggested action plan for rapid implementation of infection control measures in settings with sporadic occurrence or complete absence of carbapenemase-producing Gram-negatives

NDM-1: una nuova MBL negli enterobatteri

Emergenza e rapida diffusione di E Emergenza e rapida diffusione di E. coli produttore di carbapenemasi NDM-1 NDM-1

Resistenza multipla agli antibiotici in Escherichia coli produttore di carbapenemasi NDM-1

Trend % I/R Acinetobacter baumanni MDR 2009-ott Trend % I/R Acinetobacter baumanni MDR 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND In diminuzione i casi di Acinetobacter baumanni MDR

Trend % I/R Enterobacteriaceae (escluso E. coli) 2009-ott Trend % I/R Enterobacteriaceae (escluso E.coli) 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

Differenze CLSI – EUCAST CARBAPENEMI e Enterobacteriaceae Breakpoints EUCAST più bassi rispetto al CLSI CLSI 2010 EUCAST 2010 S ≤ I R ≥ Doripenem - 1 2 - 4 8 Ertapenem 2 4 0.5 Imipenem 16 4 - 8 Meropenem

Emocolture 2010 (1)

Emocolture 2010 (2)

Clone circolante di P.aerugionosa R ai carbapenemi

% I/R per Reparti

Caratteristiche Cliniche delle ESBL Anche quando sensibili in vitro alle Cefalosporine di quarta generazione, si hanno fallimenti terapeutici in clinica Generano difficoltà cliniche a causa della resistenza crociata con altre classi di antibiotici (p.es. Aminoglicosidi) Sono associate ad epidemie ospedaliere caratterizzate da alte morbidità e mortalità Determinano un sovrautilizzo di altri antibiotici ad ampio spettro

? …. riepilogando : SI NO S R ESBL AmpC inducibile plasmidica Posizione dei geni di resistenza Plasmidica Cromosomica Più spesso trovata in E. coli Klebsiella spp. P.mirabilis altre Enterobacter C. freundii S. marcescens M. morganii Providencia spp. Proteus rettgeri Inibizione da Acido clavulanico SI NO Cefoxitina - Cefotetan S R Test fenotipici A volte No ? Refertazione Refertare tutte le Cefalosporine, Penicilline e Aztreonam come resistenti Aggiungere commento

β-lattamasi di tipo AmpC a basso livello E. coli Shigella P.mirabilis costitutiva ad alto livello (ceppi iperproduttori) cromosomica Enterobacter C. Freundii M. Morganii Providencia Serratia P.aeruginosa inducibile (transitoria) derepressa (stabile) E. coli Klebsiella plasmidica

Problematiche Cliniche della -lattamasi AmpC Alcune molecole ( aminocilline, cef. 1°g, a.clav.) sono forti induttori Altre ( cef. 3°g., ureidopenicilline ) sono deboli induttori ma possono selezionare mutanti derepressi La produzione di enzima indotta o costitutiva può causare fallimenti terapeutici

 -lattamasi AmpC derepressa Le Cefalosporine selezionano mutanti derepressi da popolazioni inducibile Selezione si ha in circa il 20% delle batteriemia da Enterobacter molti isolati di Enterobacter e di C. freundii sono oggi derepressi al primo isolamento

Studio OASIS 20 Centri (2007-2008) I dati di sorveglianza oggi disponibili Studio OASIS 20 Centri (2007-2008) Coordinatori: G. Gesu F. Luzzaro G. Ortisi 20 Laboratori di Microbiologia Ospedali ≥ 500 posti letto ≥ 5000 emocolture/anno Strumentazioni automatiche (a monitoraggio continuo) per l’esecuzione delle emocolture

E. coli produttore di ESBL Studio OASIS E. coli produttore di ESBL 10 - 15% < 10% 16 - 20% > 20% Tot. isolati: 1278 Tot. testati: 555 ESBL-pos.: 15.1% 117

K. pneumoniae produttore di ESBL Studio OASIS K. pneumoniae produttore di ESBL 10 - 30% < 10% 31 - 50% > 50% Tot. isolati: 552 Tot. testati: 258 ESBL-pos.: 26.7% 118

P. mirabilis produttore di ESBL Studio OASIS P. mirabilis produttore di ESBL < 15% 15 - 30% 31 - 50% > 50% Tot. isolati: 204 Tot. testati: 152 ESBL-pos.: 32.2% 119

P. mirabilis produttore di AmpC Studio OASIS P. mirabilis produttore di AmpC None < 15% 15 - 30% 31 - 50% > 50% Tot. isolati: 204 Tot. testati: 152 CBL-pos.: 16.4% 120

Screening positivo per la produzione di ESBL Screening e conferma della produzione di ESBL nelle Enterobacteriaceae CEFTAZIDIMEa e/o CEFOTAXIME Screening positivo per la produzione di ESBL MIC  2 mg/L Escherichia colib Proteus mirabilis Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Test di conferma per la produzione di ESBL ESBL – SI NO Specie che producono b-lattamasi cromosomiche di classe C (per esempio, Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Providencia spp. ) Microbiologia Medica 2007; 22:281-290 121

BETA-LATTAMICI ed Enterobacteriaceae CLSI 2009 Regola esperta: in presenza di ESBL, refertare tutte le penicilline, le cefalosporine e l’aztreonam RESISTENTI

Beta-lattamici ed Enterobacteriaceae Differenze tra criteri interpretativi secondo EUCAST e CLSI CLSI 2010 EUCAST 2010 S ≤ I R ≥ Cefepime 8 16 32 1 2 - 4 Cefotaxime 2 4 = Ceftazidime Ceftriaxone Aztreonam

S E R V I Z I O DI M I C R O B I O L O G I A E V I R O L O G I A ** LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA ** DIRETTORE DOTT. FABIO RUMPIANESI SIG. C UROLOGIA/156 A nato il :30/07/1951 prenotato il 17/11/2010 n. 459 prelievo del 17/11/2010 alle 18:06 Descrizione Esito ---------------------------------------------------------------------------- MICROBIOLOGIA Materiale: SANGUE Colturale batteri,miceti aerob. Automazione Bactec POSITIVO Microscopico da fl.Bactec aerobio Bacilli Gram-Negativi

Colturale batteri anaerobiosi Automazione Bactec POSITIVO Microscopico da fl.Bactec anaerob Bacilli Gram-Negativi Identificazione 1 anaerobiosi Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia Antibiogramma 1 anaerobiosi Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia Antibiogramma definitivo: la determinazione delle MIC per piperacillina/tazobactam, imipenem e meropenem sono state eseguite con metodo E-TEST. - range sensibilità M.I.C. - Amikacina 4 S <= 16 Amoxicillina/A.CLAV. >=32 R <= 8 Ampicillina >=32 R <= 8 Cefazolina >=128 R <= 8 Cefepime >=64 R <= 8 Cefotaxime >=64 R <= 8 Ceftazidime >=64 R <= 8 ESBL POS + Gentamicina >=16 R <= 4 Imipenem 0,25 S <= 4 Levofloxacin >=8 R <= 2 Meropenem 1,5 S <= 1 Norfloxacina >=16 R <= 4 Piperacillina >=128 R <= 16 Piperacillina/tazobactam >=256 R <= 128 Trimetoprim/Sulfam. >=320 R <= 40 Tygeciclina 2 S <=0,012 =>256