Nature 213, 399-400 (28 January 1967) | doi:10.1038/213399a0 Reduction of Methaemoglobin in Haemoglobin Samples using Gel Filtration for Continuous Removal of Reaction Products H. B. F. DIXON & R. McINTOSH* Department of Biochemistry, Cambridge. *Medical Research Council Abnormal Haemoglobin Research Unit. Abstract EVEN a small degree of oxidation of haemoglobin to methaemoglobin, such as occurs in the transport and storage of frozen red cells, interferes with the study of its oxygen dissociating properties. When abnormal are separated from normal haemoglobins, even more methaemoglobin accumulates during the manipulations involved. The methaemoglobin may be efficiently reduced by passing a haemolysate of such a partly oxidized sample by means of gel nitration through a band of reducing agent. Advantages of this method are that the methaemoglobin constantly encounters fresh reducing agent and that the continued elution quickly removes the haemoglobin formed from excess reagent. These factors are important when reduction is by dithionite, as side reactions can then destroy the haemoglobin. A similar principle can be applied to the oxidation of cytochromes1, and to the conversion of the aldimine form of aspartate aminotransferase (E.C. 2.6.1.1) into the amino form by transamination with an amino-acid2. The continuous removal of the  -oxoacid formed is particularly important in the latter case because the position of equilibrium is unfavourable to formation of the amino form.

CROMATOGRAFIA Tecnica di separazione di molecole tra FASE STAZIONARIA FASE MOBILE La separazione si ottiene perché le sostanze migrano con diversa velocità attraverso la fase stazionaria La migrazione è provocata dal flusso della fase mobile o eluente

FASE STAZIONARIA Particelle di determinate dimensioni impaccate su colonna o stratificate su un supporto solido (strato sottile) FASE MOBILE Viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria SOSTANZE Vengono trasportate lungo la fase stazionaria dalla fase mobile

CROMATOGRAFIA AD ADSORBIMENTO: le sostanze interagiscono con la superficie delle particelle costituenti la fase stazionaria CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE: le sostanze si separano in base alla diversa ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile GEL CROMATOGRAFIA (ad esclusione molecolare): La fase stazionaria è rappresentata da un GEL, attraverso cui scorre l’eluente GEL: viene preparato permettendo il rigonfiamento delle particelle in eccesso di eluente Generalmente la matrice del gel possiede gruppi idrofilice (-OH) Il gel viene impaccato mediante il passaggio di eluente attraverso di essa

Sephadex E’ costituito da DESTRANO, un polisaccaride costituito da residui di glucosio Viene prodotto da ceppi differenti di Leuconostoc mesenteroides che crescono in un medium contenente saccarosio Successivamente il destrano viene polimerizzato con EPICLOROIDRINA

Tre stadi nel corso della separazione low molecular weight high molecular weight Gel particles Principio di ripartizione: le molecole piccole possono entrare nel gel attraverso i grani della fase stazionaria (equilibrio dinamico) le molecole più grosse passano attraverso i grani di gel senza interagire con esso il sistema può essere complicato a causa di particolari interazioni con la matrice del gel

Aggiungo prima ditionito di sodio Poi metaemoglobina ESERCITAZIONE K 3Fe(CN)6 Na2S2O4 Sangue metaemoglobina emoglobina emoglobina ossigenata Fe(III) marrone Fe(II) rosso porpora rosso +3 4H2O +6 6Fe3++S2O42- 2SO42- + 8H+ + 6Fe2+ Aggiungo prima ditionito di sodio Poi metaemoglobina metaemoglobina marrone ditionito rosso porpora rosso

Principio La metaemoglobina è più veloce e raggiunge il ditionito tornando allo stato di ossidazione Fe(II) assumendo quindi la colorazione rossa e successivamente rosso più chiaro grazie alla presenza di molecole di ossigeno presenti all’interno della colonna