UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di Scienze MM. FF. NN. Corso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni Biomediche TISSUE ENGINEERING COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI SU SUPPORTO DI PLASMA Relatori Chiar. ma Prof. ssa Renata Franchi Gazzola Correlatori Chiar. mo Dott. Stefano Negri Laureanda Elena Alessi Anno Accademico 2007/2008

TISSUE ENGINEERING PRINCIPI Area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo PRINCIPI Prelevare le cellule staminali del Paziente Far crescere e differenziare le cellule su un supporto biologico Sottoporre il Paziente al trapianto

BIOMATERIALI devono possedere le seguenti caratteristiche: tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti (biocompatibili) impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario (biodegradabili) contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite

LE MATRICI PIU’ IDONEE.. Per la crescita e differenziazione di cheratinociti e fibroblasti autologhi, le matrici più idonee, sono di tipo naturale e si suddividono in: - collagene - agarosio - acido ialuronico - colla di fibrina - cellulosa Grande interesse è rivolto verso l’utilizzo del plasma umano come supporto di crescita per cheratinociti e fibroblasti

SCOPO TESI Isolare cheratinociti e fibroblasti umani, utilizzando il plasma autologo per formare lembi di cute con caratteristiche morfo-funzionali e immunoistochimiche simili all’epidermide normale

CASO CLINICO V. P. di anni 65, affetta da ulcera vascolare venosa circonferenziale alla gamba sinistra.

MATERIALI E METODI Estrazione e amplificazione di cheratinociti e fibroblasti umani autologhi, prelevati da un’unica biopsia Preparazione del supporto di plasma Aggiunta di fibroblasti e cheratinociti a diverse densità

PREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMA ACIDO TRANEXAMICO PLASMA SOLUZIONE FISIOLOGICA CLORURO DI CALCIO + FIBROBLASTI + CHERATINOCITI 30’, 37°C, 5% CO2

CONSISTENZA DEL SUPPORTO PLASMA AC. TRANEXAMICO NaCl CaCl2 QUANTITÀ DI SOLUZIONE PER POZZETTO 5 ml 5 mg 6,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml 1 ml, 1,5% 6 mg 6 ml 5,5 ml

DENSITA’ DI SEMINA FIBROBLASTI 5X104/cm2 10X104/cm2 15X104/cm2 CHERATINOCITI 5X104/cm2 FU KE 10X104/cm2 15X104/cm2

- MODALITA’ DI SEMINA t0 FIBROBLASTI CHERATINOCITI t1 (dopo 1 giorno)  - t2 (dopo 4 giorni) t3 (dopo 8 giorni)

PRELIEVO 4 giorni 8 giorni 13 giorni i frammenti di cute artificiale sono stati prelevati per: Valutazione della consistenza ottimale Valutazione della densità cellulare ottimale Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche

microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X) COLTURA PRIMARIA cheratinociti fibroblasti 3T3 microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X)

microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X) COLTURA SECONDARIA cheratinociti fibroblasti microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X)

microscopio a contrasto di fase (400X) FIBROBLASTI Derma Fibroblasti microscopio a contrasto di fase (400X)

microscopio a contrasto di fase (400X) FIBROBLASTI microscopio a contrasto di fase (400X)

microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X) FIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMA microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X)

microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X) cheratinociti fibroblasti microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X)

FRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALE Ematossilina-Eosina (400X)

Ematossilina-Eosina (400X) FIBROBLASTI Ematossilina-Eosina (400X)

Ematossilina-Eosina (400X) CHERATINOCITI Ematossilina-Eosina (400X)

immunoistochimica: vimentina (400X) FIBROBLASTI immunoistochimica: vimentina (400X)

immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X) CHERATINOCITI immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X)

immunoistochimica: collageno IV MEMBRANA BASALE immunoistochimica: collageno IV

immunoistochimica: Mib1

APPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTE

INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE prima...

INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE ..dopo

innesti del tutto autologhi CONCLUSIONI SVANTAGGI VANTAGGI  Supporto fragile e poco maneggevole  Permette di ottenere innesti del tutto autologhi    Facile da preparare  Basso costo