Le correnti elettriche che attraversano la membrana cellulare sono mediate da proteine integrali di membrana dette canali ionici o pori. Il primo studio.

Presentazione sul tema: "Le correnti elettriche che attraversano la membrana cellulare sono mediate da proteine integrali di membrana dette canali ionici o pori. Il primo studio."— Transcript della presentazione:

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2 Le correnti elettriche che attraversano la membrana cellulare sono mediate da proteine integrali di membrana dette canali ionici o pori. Il primo studio diretto dei canali è stato fatto su membrane lipidiche artificiali formando canali con l’antibiotico gramicidina. In vivo il problema maggiore è misurare correnti dell’ordine del pA in presenza di un noise di fondo.

3 Transmembrane Transport Comunicazione fra neuroni  Sistemi nervosi  Signaling sinaptico Muscolo cardiaco Processi di signaling Comunicazione fra neuroni  Sistemi nervosi  Signaling sinaptico Muscolo cardiaco Processi di signaling Cystic fibrosis EpilepsyDiabetesMigrainesNeuro-toxins EpilepsyDiabetesMigrainesNeuro-toxins Channel malfunction

4 Gramicidin A in DMPC lipid bilayer and water Antibiotic peptide Forms a pore in the cell wall of a bacteria and lets out monovalent cations (K+, Na+). [Membrane potential disappears and bacteria dies!] 15 amino acids, helical Channel is formed by a head- to-head dimer Antibiotic peptide Forms a pore in the cell wall of a bacteria and lets out monovalent cations (K+, Na+). [Membrane potential disappears and bacteria dies!] 15 amino acids, helical Channel is formed by a head- to-head dimer

5 Tale problema è stato risolto da Neher e Sakmann. Invece di inserire un microelettrodo all’interno della cellula hanno pressato la punta di un elettrodo sulla superficie della membrana. Il noise intrinseco aumenta con l’area della membrana e quando una piccola porzione (1-10μm 2 ) viene isolata, i livelli di noise sono così bassi che le correnti che fluiscono attraverso un singolo canale possono essere misurate direttamente.

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7 La tecnica del patch-clamp permise all’inizio di risolvere le correnti che passano attraverso canali ACh-attivati sulla membrana di muscolo scheletrico di rana. Il metodo utilizzato e poi successivamente rifinito da Hamill (Hamill, Marty, Neher, Sakmann & Sigworth, 1981) ha portato alla possibilità di registrare in alta risoluzione correnti da excised membrane patches in aggiunta alle misure fatte in cell-attached.

8 Le registrazioni di singolo canale forniscono informazioni sulla conduttanza unitaria, comportamento cinetico dei canali ionici già in parte studiati con il classico voltage-clamp. Inoltre tale tecnica h apermesso di applicare potenziale anche a cellule piccole, troppo piccole per i metodi classici di voltage-clamp. In più si è chiarito il ruolo fisiologico dei canali di membrana in cellule anche non elettricamente eccitabili.

9 Più recentemente questa tecnica è stata utilizzata anche per accoppiare l’introduzione nella cellula di fluorofori per misure quantitative di calcio, magnesio e sodio. Similmente vari composti detti caged compounds sono introdotti nelle cellule per studiare il ruolo di secondi messaggeri in seguito ad attivazione per fotolisi.

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11 Il principio base del metodo è isolare elettricamente un patch di membrana dalla soluzione esterna e registrare le correnti che passano attraverso il patch. Questo si può ottenere pressando una pipetta di vetro fiammata (e quindi arrotondata in punta) e riempita con una soluzione di elettroliti, sulla membrana della cellula in esame e applicando una leggera suzione. Una condizione necessaria è che sia la membrana che la pipetta siano pulite: in queste condizioni si forma un sigillo fra pipetta e membrana dell’ordine di 10GΩ.

12 La formazione di un sigillo ad alta resistenza è necessaria per due motivi: Più elevata è la reistenza migliore è l’isolamento elettrico del patchPiù elevata è la reistenza migliore è l’isolamento elettrico del patch Viene ridotto notevolmente il noise di fondo permettendo quindi una migliore risoluzione temporale delle correnti di singolo canale la cui ampiezza è dell’ordine di 1pA.Viene ridotto notevolmente il noise di fondo permettendo quindi una migliore risoluzione temporale delle correnti di singolo canale la cui ampiezza è dell’ordine di 1pA.

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14 Le condizioni richieste e fondamentali per la formazione di un gigaseal sono:  La superficie della membrana cellulare deve essere pulita e priva di matrice extracellulare e tessuto connettivo. Le cellule in coltura sono preferibili; le cellule adulte devono essere generalmente pulite enzimaticamente o meccanicamente  La punta dlel’elettrodo di vetro viene pulita fiammeggiandola

15  Le soluzioni utilzzate devono essere ripulite da corpuscoli di polvere e macromolecole come ad esempio i componenti del siero nei mezzi di coltura. Le soluzioni sono filtrate utilizzando i filtri da 0.2 µm. Le cellule in coltura sono sciacquate numerose volte prima di essere utilizzate.  Appena prima di formare il seal si applica alla pipetta una pressione positiva in modo da produrre un piccolo flusso in uscita dalla pipetta e mantenerla pulita.

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17 Ion channels mediate a controlled passage of ions over the plasma membrane of cells. Due to their electric charge, ions cannot enter the plasma membrane itself. One way for ions into or out of the cell are the gated pores of ion channel proteins. These pores are short tubular structures in the middle of the protein that serve to strip the hydration shell off the ion and allow its passage to the opposite side of the membrane. Ion channels are passive transporters. They do not supply energy for ion transport, they simply allow electrodiffusion which is solely driven by the electrochemical potential gradient across the membrane. Most ion channels conduct only one species of ion. The most prominent channels are sodium channels, potassium channels, calcium channels and chloride channels.

18 Ion channel pores are not always open. They can be opened and closed according to the cell´s requirements. Specialized structures within the protein serve as gates that control the passage of ions. These gates have a fundamental significance for all living organisms: Opening and closing of channel gates ("gating") is the basis of most forms of communication between cells, as virtually every biological signal acts directly or indirectly on a channel gate. Gates can be controlled chemically (ligand-gated channel), as in transmitter- gated or calcium-gated channels, or electrically, as in the voltage-gated channels in excitable cells. In both cases: when the gate opens, current flows over the membrane, the current stops when the gate is closed.

19 La corrente che passa attraverso un singolo canale può essere registrata in patch-clamp: l’apertura e la chiusura del canale sono identificabili con due diversi livelli. La chiusura mostra un background di noise che determina il livello di zero corrente e un’apertura tutto-o-niente quando il canale si apre. La probabilità che il canale si apra dipende da diversi fattori che sono il controllo del canale come ad esempio la concentrazione di un ligando o la differenza di potenziale applicata.

20 cAMP gated channel (first trace: 5 µM cAMP, last trace: 300 µM cAMP). Opening of the gate causes a sudden current increase by 1.5 pA (1.5 x 10 -12 A). The higher the cAMP concentration, the higher is the open probability of the channel. The patch-clamp method thus makes it possible to watch a single molecule C O

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22 Si utilizza un microscopio invertito a contrasto di fase montato all’interno di una gabbia di Farady 1 che è necessaria per proteggere l’apparato da AC noise che può derivare dalla lampada del microscopio, dai cavi BNC e dall’equipaggiamento elettronico del set-up. Un macromanipolatore (idraulico, meccanico) e un micromanipolatore (piezoelettrico) 2 portano l’elettrodo sulla cellula. Un preamplificatore ad alto guadagno e basso noise intrinseco ed un amplificatore consentono la registrazione in alta risoluzione. Un sistema di perfusione applica le diverse soluzioni al bagno 3.

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25 The patch-clamp recording is often combined with recording of fluorescence from single cells. Using ion- sensitive fluorescent dyes enables us to relate currents conducted by ion channels with changes in intracellular ion concentration caused by that current - a technique that is particularly important for investigating calcium-permeable channels or calcium-gated channels. For this method, the set up contains lamps, filter wheels, photomultipliers and a camera, which control and record the fluorescence signals

26 Le pipette di registrazione che cotengono il filamento di platino-iridio sono fatte utilizzando un puller che scalda il vetro con una resistenza in un processo multistep e poi sono forgiate in modo da ottenere pipette con un diametro di 1µm. Il bordo è arrotondato in modo da non lesionare la membrana cellulare.

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28 To measure cell activity, it is necessary to make good contact between the pipet and cell membrane. This is done by sucking. This single frog myocyte (left) is being picked up by sucking on the pipet. Once good contact is made, it is possible to record ion channels opening and closing ion channelsion channels

29 Coating pipettes to reduce capacitance Pipettes used in single channel recording are usually coated to thicken their walls and reduce capacitance to the bath solution. There are two reasons for wishing to minimize this stray capacitance. First, high frequency noise levels are reduced and secondly, as mentioned above, capacity currents associated with stepping the potential of the inside of the pipette are also reduced.

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31 Cell attached Il primo passo nella registrazione di patch-clamp è come abbiamo visto la formazione di un seal ad alta resistenza (GΩ) fra elettrodo e membrana, applicando una lieve suzione per risucchiare la membrana all’interno della pipetta. Quando il seal è formato siamo nella configurazione di cell-attached: il patch di membrana è isolato dal bagno esterno, ma è ancora influenzato dal medium intracellulare, cioè si misura l’attività di canali ancora influenzati da secondi messaggeri e modulatori fisiologici della cellula

32 Inside-out Dalla configurazione di cell-attached si tira indietro delicatamente la pipetta. Questo determina il distacco di un piccolo pezzetto di membrana. Per evitare che le due parti del pezzetto si richiudano su se stesse è bene estrarre dal bagno la pipetta per un secondo e poi reimmergela. Riempendo la pipetta con una soluzione simile alle soluzioni extracellulari è possibile studiare l’effetto di diversi modulatori intracellulari sui canali.

33 Whole cell Alternativamente dal cell-attached si arriva alla configurazione di whole-cell. Bisogna penetrare all’interno della cellula con la pipetta applicando una suzione negativa. Poiché il volume della soluzione nella pipetta è molto maggiore che il volume intracellulare, si arriva ad un rapido equilibrio con la soluzione della pipetta. Tale configurazione consente di misurare le correnti che attraversano TUTTA la membrana cellulare. Risulta utile come tecnica soprattutto per i neuroni che hanno un corpo cellulare molto piccolo e non si riescono ad impalare con il voltage clamp classico.

34 Outside-out Dalla configurazione whole-cell si può anche ritirare delicatamente la pipetta facendo sì che la membrana si rompa e le estremità libere si risigillino sul vetro. La vescicola che si forma si riempie con la soluzione della pipetta. La soluzione nel bagno viene ad essere la soluzione extracellulare, mentre l’interno della pipetta mima un fluido intracellulare. Questo permette di studiare le variazioni del liquido extracellulare come ad esempio variazioni di neurotrasmettitori sui canali della membrana.

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36 http://www.iac-usnc.org/Methods/wholecell/equipment.htmlwww.iac-usnc.org/Methods/wholecell/equipment.html

37 Esempi

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39 Single-channel recordings

40 Cosa vediamo attraverso il microscopio?

41 Studiare la farmacologia del recettore GABA A

42 Relazione fra whole-cell e singolo-canale

43 Patching Deiters' cells. Deiters' cells can be patched too, after peeling off the Hensen's cells. In this image a pair of adjacent Deiters' cells was simultanesously patch-clamped by two pipettes connected to different amplifiers to measure gap junction conductactance. Patching Deiters' cells. Deiters' cells can be patched too, after peeling off the Hensen's cells. In this image a pair of adjacent Deiters' cells was simultanesously patch-clamped by two pipettes connected to different amplifiers to measure gap junction conductactance.

44 Image of two culture hippocampal neurons just before whole cell patch clamp.

45 Simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recording from a Purkinje cell in a cerebellar cortex slice. A, infrared differential interference contrast image. B, fluorescence image (Cascade Blue and Lucifer Yellow in somatic and dendritic pipettes, respectively).

46 Simultaneous quadruple patch-clamp recording from layer 5 pyramidal neurons in a cortical brain slice. Neurons were filled with a fluorescent calcium indicator and imaged with 2-photon laser- scanning microscopy.

47 COME SI IDENTIFICANO I CANALI?

48 Channel Families  Voltage-gated  Extracellular ligand-gated  Intracellular ligand-gated  Inward rectifier  Intercellular  Other sodium: I, II, III, µ1, H1, PN3sodium: I, II, III, µ1, H1, PN3 potassium: K A, K v (1-5), K v (r), K v (s),K SR, BK Ca, IK Ca, SK Ca, K M, K AChpotassium: K A, K v (1-5), K v (r), K v (s),K SR, BK Ca, IK Ca, SK Ca, K M, K ACh calcium: L, N, P, Q, Tcalcium: L, N, P, Q, T chloride: ClC-0 - ClC-8chloride: ClC-0 - ClC-8 sodium: I, II, III, µ1, H1, PN3sodium: I, II, III, µ1, H1, PN3 potassium: K A, K v (1-5), K v (r), K v (s),K SR, BK Ca, IK Ca, SK Ca, K M, K AChpotassium: K A, K v (1-5), K v (r), K v (s),K SR, BK Ca, IK Ca, SK Ca, K M, K ACh calcium: L, N, P, Q, Tcalcium: L, N, P, Q, T chloride: ClC-0 - ClC-8chloride: ClC-0 - ClC-8 nicotinic ACh (muscle):  2  (embryonic),  2  (adult) nicotinic ACh (neuronal):  (2-10),  (2-4) glutamate: NMDA, kainate, AMPA P2X (ATP) 5-HT 3 GABA A :  (1-6),  (1-4),  (1-4), , ,  (1- 3) Glycine nicotinic ACh (muscle):  2  (embryonic),  2  (adult) nicotinic ACh (neuronal):  (2-10),  (2-4) glutamate: NMDA, kainate, AMPA P2X (ATP) 5-HT 3 GABA A :  (1-6),  (1-4),  (1-4), , ,  (1- 3) Glycine leukotriene C 4 -gated Ca 2+ ryanodine receptor Ca 2+ IP 3 -gated Ca 2+ IP 4 -gated Ca 2+ Ca 2+ -gated K + Ca 2+ -gated non- selective cation leukotriene C 4 -gated Ca 2+ ryanodine receptor Ca 2+ IP 3 -gated Ca 2+ IP 4 -gated Ca 2+ Ca 2+ -gated K + Ca 2+ -gated non- selective cation Ca 2+ -gated Cl – cAMP cation cGMP cation cAMP chloride ATP Cl – volume-regulated Cl – arachidonic acid- activated K + Na + -gated K + Ca 2+ -gated Cl – cAMP cation cGMP cation cAMP chloride ATP Cl – volume-regulated Cl – arachidonic acid- activated K + Na + -gated K + Kir 1.1-1.3 2.1-2.4 3.1-3.5 4.1-4.2 5.1 6.1-6.2 7.1 Kir 1.1-1.3 2.1-2.4 3.1-3.5 4.1-4.2 5.1 6.1-6.2 7.1 Gap junction channels Cx26 Cx32 Cx37 Cx40 Cx43 Cx45 Cx50 Cx56 Gap junction channels Cx26 Cx32 Cx37 Cx40 Cx43 Cx45 Cx50 Cx56 Mechanosensitive Mitochondrial Nuclear Aquaporins Vesicular (synaptophysin) Mechanosensitive Mitochondrial Nuclear Aquaporins Vesicular (synaptophysin)

49 I canali possono essere identificati in base a: 1. Modalità di attivazione 2. Ioni permeanti (purché si rispettino le condizioni fisiologiche) 3. Conduttanza unitaria 4. Blocco selettivo con ioni, tossine o agenti farmacologici

50 1. I canali possono essere aperti…..  Neurotrasmettitori o analoghi chimici agendo su un recettore esterno accoppiato direttamente al meccanismo di apertura del canale. La probabilità di apertura di questi canali dipende dalla concentrazione del neurotrasmettitore. Sono di solito coinvolti nell’attivazione di sinapsi rapide (nAChR e NMDA)

51  Potenziale di membrana come nel caso dei canali Na +, K + e Ca 2+ che si aprono durante un potenziale d’azione.

52  Ioni intracellulari che variano in concentrazione (es.: Ca-activated K-channels) o altri composti (ATP, cGMP…)  La probabilità di apertura di alcuni canali è modificata dai secondi messaggeri che si formano per azione di un ormone. Ad esempio il canale del calcio cardiaco che si fosforila in seguito all’attivazione di PKA

53 2. Permeabiltà agli ioni Una volta che un canale si è aperto il tipo di ioni che possono passare è determinato dalla selettività del poro (in base alla carica), dalle dimensionio del poro e dalla concentrazione degli ioni rispetto al potenziale di inversione del canale

54 3. Conduttanza unitaria La conduttanza unitaria di un canale può variare notevolmente in certe situazioni. Canali permeanti agli stessi ioni hanno conduttanza diverse, come ad esempio i canali K Ca-attivati di cui esistono tre diversi tipi.

55 4. Blocco selettivo Alcuni canali sono selettivamente bloccati da basse concentrazioni di farmaci o tossine. Ad esempio i canali del Na sono bloccato da TTX, i canali K ritardati da derivati del TEA, il recettore nicotinico da α-bungarotossina. Il blocco da parte di altre sostanze può essere meno selettivo come ad esempio l’azione bloccante di anestetici locali sui canali del Na e sui recettori nicotinici, oppure l’azione bloccante del chimno sul K.