11 MIRA Mechanisms Involved in Radiofrequency-induced Adaptive response.

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1 11 MIRA Mechanisms Involved in Radiofrequency-induced Adaptive response

2 MIRA La risposta adattativa (RA) si osserva quando cellule esposte a basse dosi, non citotossiche, di un agente genotossico chimico o fisico (adaptative dose, AD o priming dose) diventano resistenti a una successiva, ma più elevata e genotossica, dose di uno stesso o altro agente genotossico (challenge dose, CD). Per quanto riguarda le radiazioni ionizzanti (RI) la RA è stata riportata sia in vitro sia in vivo 2 damage smaller damage Challenge dose Adaptation dose

3 NOTI i fattori che influiscono: il fenomeno mostra un alto grado di variabilità inter- e intra-individuale (50% - 75% della popolazione esibisce adattamento), Età (non si osserva in individui di età maggiore di 60 anni) intervallo di tempo tra la somministrazione della AD e della CD, dose rate (per le IR), fase del ciclo cellulare. PROPOSTI diversi meccanismi di azione, a tutt’oggi non ne è stato individuato uno universalmente condiviso l’argomento è particolarmente attraente in quanto potrebbe interessare la protezione di individui professionalmente esposti (dall’ ambito aerospaziale, alle centrali nucleari, o agli ospedali) o per applicazioni medicali. Risposta Adattativa (AR)

4 Nel 2009 per la prima volta è stato dimostrato che le RadioFrequenze (agente non genotossico) sono in grado di indurre AR nei confronti di un mutageno chimico: il chemioterapico Mitomicina C (MMC) A. Sannino, M. Sarti, S.B. Reddy, T.J.Prihoda, Vijalaxami, M.R. Scarfì: Induction of AR in Human Lymphocytes exposed to RF Radiation, Rad Res, 171, 735-742, 2009 Segnale 900 MHz GSM SAR medio 1.25W/kg No effetto termico Stato dell’arte AR-RF

5 t=0t=24ht=48ht=72h PHACyt-BCD-MMC Cell harvest t=44h S phase RF segnale 1950 MHz UMTS, 0.3 W/kg Zeni et al 2012 Ciclo Cellulare Definizione fase per l’applicazione del segnale in Sannino et al Int J Rad Biol.2011 A. Sannino, M. Sarti, S.B. Reddy, T.J.Prihoda, Vijalaxami, M.R. Scarfì: Induction of AR in Human Lymphocytes exposed to 900 MHz RF fields: Influence of cell cycle, Int. J Rad Biology, 2011 Zeni O., Sannino A., Romeo S., Massa R., Sarti M, Reddy AB, Prihoda TJ, Vijalaxami, Scarfi MR: Induction of AR in human blood lymphocytes exposed to RF: influence of UMTS signal and Specific Absorption Rate, Mutation Res 2012 AR-RF

6 Risultati ARCAICA A. Sannino, O. Zeni, S. Romeo, R. Massa, G. Gialanella, G. Grossi, L. Manti, Vijalaxmi, MR Scarfì: Adaptive response in human blood lymphocytes exposed to non-ionizing radiofrequency fields: resistance to ionizing radiation-induced damage, J. of Radiation Research, 2013, pp 1–8, doi: 10.1093/jrr/rrt106 AD:NIR (0.3W/kg) AD:IR (1 cGy)

7 Fermo restando che il danno indotto dalla Radiazione Ionizzante (IR) è di natura diversa da quello causato da MMC (rotture della doppia elica vs. alchilazione delle basi del DNA), i campi RF (segnali telefonia cellulare) possono mitigare anche l’azione della IR??? YES! Working hypothesis ARCAICA

8 8 Gruppi di ricerca indipendenti hanno confermato l’effetto protettivo delle RF nei confronti dei raggi  in esperimenti in vivo e in vitro. AR-RF Cao et al,Int J Rad Biol, 2011 Cao et al,J Tox. Env Health, 2010 Jiang et al,PlosOne, 2012

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10 10 THAM-E.6 09:45 Radiofrequency radiation may help astronauts in space missions Hamid Abdollahi*, Kerman University of Medical Sciences ; Sara Khademi, Mashhad University of Medical Sciences Abstract: The biological effects of space radiations on astronauts are the main concern in deep space missions. Many investigations have been made to find the best way to overcome those problems in extended space travels. There are some studies showing that radiofrequency radiation can induce adaptive responses in human cells and animals during which they become more resistant against challenging doses of mutagenic agents such as high levels of radiation. We suggest that radiofrequency radiation as an agent that induces adaptive response may help astronauts in space flights. Exposure to radiofrequency radiation before or during space missions while choosing the optimised dosimetric parameters such as determined power density and frequency and duration of exposure can help astronauts in their travels 58° Annual Meeting on the Health Physics Society July 2013

11 11 Si propone: lo studio e la caratterizzazione dei meccanismi coinvolti nel fenomeno della AR- RF in colture cellulari trattate con agenti chimici o fisici Saranno esaminati alcuni dei meccanismi proposti per motivare l’adattamento da mutageni sia chimici sia fisici (Dimova et al 2008, Miura 2004, Wiencke et al 1986, Vijayalaxami and Burkat 1989, Ikushima et al 198), mediante tecniche di citofluorimetra e biologia molecolare. MIRA (Mechanisms Involved in Radiofrequency- induced Adaptive response) I meccanismi d’azione alla base di questo effetto non sono attualmente noti e la loro caratterizzazione porterebbe un contributo fondamentale per poter ad es definire le modalità di applicazione sui tessuti sani e tumorali che hanno comportamenti dielettrici diversi nonché sensibilità diverse nei confronti della chemio o radio terapia. Lo studio dei meccanismi di azione delle NIR sui sistemi biologici porterebbe ad un avanzamento delle conoscenze su questo argomento per il quale l’OMS ha una grande attenzione e che rientra nelle tematiche di interesse del programma Horizon2020.

12 Milestone 1: T0-T6. Nel primo anno verr à effettuato un primo set di esperimenti di AR-RF in linfociti da sangue periferico di donatori sani nei confronti del danno indotto dall ’ agente challenge secondo i protocolli gi à assestati dall ’ UONA. Verranno confrontati i risultati ottenuti negli esposti e negli sham-esposti (campioni collocati negli applicatori non collegati alla sorgente a RF). In particolare la stima del danno cellulare verr à valutato mediante il test del micronucleo e sar à data indicazione se il donatore è un responder o un non responder (UONA). EXP SHAM Milestone 1Deliverable Deliverable UO-Na INDIVIDUAZIONE DEI SOGGETTI RESPONDER E DEI CAMPIONI CHE DEVONO ESSERE ANALIZZATI DA UOBO

13 Linfociti umani esposti ad un segnale UMTS 1950 MHz (WHITHER, CdC ICT) Calabrese ML, d’Ambrosio G., Massa R., Petraglia G. : A high efficiency waveguide applicator for in vitro exposure of mammalian cells at 1.95 GHz, IEEE MTT,54 (5), 2006 Romeo S., D’Avino C., Pinchera D., Zeni O., Scarfi’ MR., Massa R.: “ A waveguide applicator for in vitro exposures to single or multiple ICT frequencies”, IEEE MTT ; 61(5):1994-2004, 2013 MIRA Sistema Esposizione a RF

14 14 Milestone 2 : T2-T8 Campioni esposti alla RF (AD), SHAM, AD+CA e SHAM+CA verranno preparati e spediti presso l’UOBO che eseguirà misure high-throughput trascrittomiche. In particolare nei campioni dei due bracci sperimentali (RF e SHAM) prima e dopo il challenge verrà valutata: a) whole-genome mRNA expression mediante Microarray Hybridization technique (AffymetrixHuGene ST chips); b) whole-genome microRNA expression mediante Microarray Hybridization technique (AffymetrixmiRNA chip); c) whole-genome methylation mediante Microarray Hybridization technique (Illuminia Human Infinium 450K chip Milestone 2Deliverable Deliverable UO-Bo INDIVIDUAZIONE DELLE EVENTUALI MODIFICHE NELL’ESPRESSIONE DELL’mRNA, dei microRNA e della metilazione

15 15 Milestone 3: T4-T12 I meccanismi di risposta al danno cellulare nei due bracci sperimentali (RA e SHAM) verranno analizzati dalla UONa, nei campioni dei donatori risultati responder, mediante: a) induzione di PARP1, γ-H2AX, etc; b) espressione di heat shock protein (HSPs); c) espressione di regolatori del ciclo cellulare; d) formazione dei granuli da stress; e) test DNA mitocondriale. Milestone 3Deliverable Deliverable UO-Na ANALISI DATI E INDIVIDUAZIONE DEI MECCANISMI BIOLOGICI IPOTETICAMENTE COINVOLTI Damage sensing protein

16 16 Milestone 4: T4-T12 UOBO infine utilizzerà tecniche biostatistiche avanzate (Systems Biology, NetwokTheory, non-parametricstatistics) per l'integrazione dei dati sperimentali con database pubblici di informazione biologica a priori: a) KEGG database di pathway biochimici (contenente 260 pathway biologici, in particolare specifici per ciclo cellulare, risposta a DNA damage, pathway metabolici, etc); b) Pathwaycommons PPI database contenente il network di interazione tra proteine umane (11000 proteine, 420000 interazioni verificate sperimentalmente in vari contesti e mediante literature data mining); c) miRNA target database (ad esempio mirbase.org, mirdb.org, ncrna.org) contenente la lista dei genomici target putativi dei microRNA studiati. Milestone 4Deliverable Deliverable UO-Bo ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI OTTENUTI E SVILUPPO DEI PRIMI MODELLI BIOLOGICI.

17 17 Milestone 5: T12-T24 Si prevede che UO-Na possa validare i risultati ottenuti da UO-Bo mediante RT-PCR, quantitative RT-PCR, western blot e proteomeprofiler per la valutazione di espressione di specifici geni (sia coding che non coding) nella RA. Milestone 5Deliverable Deliverable UO-Na/Bo VALIDAZIONE DATI E PUBBLICAZIONE DEI RISULTATI

18 18 I modelli individuati (UOBO) saranno infine applicati nel terzo anno usando i raggi X (UONA) come agente challenge per approfondire gli aspetti peculiari risultati dalle analisi precedenti. Milestone 6: T24-T36 Milestone 6Deliverable Deliverable UO-Na/Bo VERIFICA DEI PRECEDENTI RISULTATI MEDIANTE AGENTE CHALLENGE CHE COINVOLGE UN DIVERSO DANNO AL DNA.

19 19 Ente di appartenenzaQualifica% R. Massa Proponente M. Quarto Università di Napoli Federico II PA RC 40 20 M. FuriaUniversità di Napoli Federico IIPO50 M. TuranoUniversità di Napoli Federico IIRC50 D. RemondiniUniversità di BolognaRC50 I. ZironiUniversità di BolognaAssegnista25 E. Gianpieri G. Menichetti Università di Bologna Assegnista Addottorando 25 50 M.R. ScarfìCNR-Istituto per il Rilevamento Elettromagnetico dell’Ambiente Primo ricercatore40 O. Zeni FTE 3.9 CNR-Istituto per il Rilevamento Elettromagnetico dell’Ambiente Ricercatore40

20 20 Alcune aziende biomedicali hanno mostrato interesse a portare su scala industriale applicatori a RF di impiego in ambito biomedicale. I lavori di Sannino et al 2009 e 2011 sono stati selezionati tra gli Highlights del CNR Attività di ricerca selezionata tra i progetti premiali (febbraio 2013). La proposta “Effetti protettivi dei CEM sul danno cellulare indotto da mutageni” ha superato la fase di preselezione PRIN2012 La valutazione degli effetti cooperativi indotti da esposizione combinate CEM (NIR) e a mutageni chimici e fisici, inclusa la AR a NIR, sarà il tema del prossimo corso della scuola Internazionale di Bioelettromagnetismo (Erice, Centro E. Majorana, aprile 2014) e uno dei direttori partecipa alla proposta del progetto MIRA Attualità e originalità della proposta

21 21 Esperienza sulla progettazione di sistemi di esposizione a RF di colture cellulari Esperienza di citogenetica e biologia molecolare Esperienza di modellizzazione di funzionalità biologiche complesse con approcci basati sulla teoria dei Network (interazione cellula – radiazione) Conoscenza approfondita dei protocolli per evidenziare l’induzione di AR da parte delle RF Impiego di tecniche innovative (saggi cellulari, rilevamenti citologici e saggi molecolari), impiegate su cellule modello, saranno in grado di evidenziare inibizione del processo induzione o riduzione di marcatori da parte della RF che partecipano al processo. Al progetto parteciperanno ricercatori dell' IREA-CNR – Napoli Sono previste collaborazioni con il Dept. of Radiation Biology, University of S. Antonio, Texas, USA e l'University of Soochow, School of Public Health, Suzhou, P.R. China

22 22 APPLICAZIONI BIOMEDICALI Technical devices for deep hyperthermia: A) high frequency induced thermo- therapy; B) RF capacitively- coupled electrodes; C) multi- antenna applicator (dipole pairs).

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