Ecologia microbica e metagenomica

Presentazione sul tema: "Ecologia microbica e metagenomica"— Transcript della presentazione:

1 Ecologia microbica e metagenomica
Problema principale: Nella microbiologia “classica”, l’isolamento e la crescita come “coltura pura” sono fondamentali per lo studio e la caratterizzazione di un microrganismo. Nelle comunità microbiche naturali, alcune reazioni metaboliche vengono effettuate da più specie: la crescita in laboratorio porta alla perdita della diversità genetica e, quindi, delle capacità metaboliche di una data comunità. Concetto di microrganismi VBNC: “Viable but not culturable” Lo studio delle metagenomica consente l’identificazione (almeno parziale) di nuove specie batteriche a partire dalle loro sequenze di DNA, SENZA la necessità di isolare e crescere queste specie in laboratorio.

2 Il problema della coltivazione

3 COLTURE DI MICRORGANISMI
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto. Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

4 MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
solido liquido

5 TERRENI DI COLTURA Terreni sintetici o definiti : COMPOSIZIONE ESATTA Terreni complessi : COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc… Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi, nucleotidim vitamine Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali per il metabolismo cellulare. Terreni selettivi Terreni differenziali Terreni di arricchimento

6 MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but does not ferment mannitol. Esempio di Terreno selettivo: MANNITOL SALT AGAR Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;

7 Proportion of major bacterial groups
isolated on different media from a water sample from the English channel Seawater agar – filtered seawater + 1.5% agar; R2A media; 1% agar – filtered seawater + 1% agar; Agarose – filtered seawater + agarose; Actinomycete media – actinomycetes selection agar (Difco); Seawater + NH4+ – filtered seawater + ammonium chloride. Microbial biotechnology 2010, 3:564

8 Analisi microbiologica dei campioni
 Metodi di rilevamento Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: 1 ml Sospensione di terreno 1 2 3 4 5 6 7 8 10-1 10-2 10-8 10-6 10-3 10-4 10-5 10-7 Tecnica del vetrino interrato Se la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo Conte dirette al microscopio ottico o all’epifluorescenza o elettronico a scansione Valori in difetto Valori in eccesso

9 Conte dirette Colorazioni vitali
Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa volte superiore. Conte dirette I valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte Colorazioni vitali Permettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle che non metabolizzano più.

10 CONTA DEI MICRORGANISMI
A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10-2 dilution. This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10-7, 10-8, and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.

11 “le colorazioni in” Ecologia microbica
colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza d’onda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza [4',6-diamidino-2-phenylindole ] Campione DAPI + Microscopio a fluorescenza

12 Microscopio ad epifluorescenza: immagini
SYBR-GREEN DAPI

13 CONTA DEI MICRORGANISMI
DAPI, syber green, arancio di acridini Sono colaranti utilizzati anche nella conta di microganismi mediante Microscopia a fluorescenza

14 Controllo dello sviluppo microbico
Sterilizzazione: è il processo in cui vengono distrutte o rimosse tutte le cellule viventi (includendo le spore, i virus e i viroidi) da un determinato habitat o da oggetti inanimati; Disinfezione: uccisione o inibizione di soli microrganismi patogeni e disinfettanti sono gli agenti chimici che vengono usati nei processi di disinfezione; Sanificazione: la carica microbica viene ridotta entro limiti considerati sicuri per gli standard di sanità pubblica;

15 Controllo dello sviluppo microbico
Antisepsi: è la pratica in grado di prevenire una infezione e si dicono antisettici i composti chimici utilizzati; Antibiotici e chemioterapici: rientrano nelle categorie dei composti in grado di controllare lo sviluppo microbico.

16 Il modello di morte microbica
La distruzione di una popolazione microbica non avviene istantaneamente con l’esposizione ad un agente letale. Dopo che la popolazione ha subito una marcata riduzione, il tasso di mortalità rallenta e ciò consente la sopravvivenza di ceppi microbici più resistenti. E’ molto difficile stabilire il punto di morte dei microrganismi: quando avviene? Generalmente quando una cellula, inoculata in brodo fresco, non dà più origine ad una progenie.

17 Figure: 20-03b Caption: Use of the autoclave for sterilization. (b) A typical autoclave cycle. Shown is the sterilization of a fairly bulky object. The temperature of the object rises more slowly than the temperature of the autoclave.

18 Figure: 20-03c Caption: Use of the autoclave for sterilization. (c) A modern research autoclave. Note the pressure-lock door and the automatic cycle controls on the right panel. The steam inlet and exhaust fittings are on the right side of the autoclave.

19 Figure: 20-04 Caption: A biological safety cabinet, shown with an ultraviolet (UV) radiation source (mercury vapor lamp), which is used for decontamination of the inside surfaces.

20 Figure: 20-08a-01 Caption: Membrane filters. (a) Assembly of a reusable membrane filter apparatus.

21 Figure: 20-08a-02 Caption: Membrane filters. (a) Assembly of a reusable membrane filter apparatus.

22 Il problema della valutazione della complessità delle comunità microbiche
La tassonomia molecolare si basa sulla similarità di sequenza tra geni che costituiscono un riferimento significativo per seguire l’evoluzione delle specie (“cronometri evolutivi” es. 16S rRNA, gene rpoB) La differenza tra OTU (Operational Taxonomic Units) è fissata al 3% di diversità nel gene marker La conoscenza ed identificazione delle diverse specie è importante per l’attribuzione di funzioni metaboliche e biochimiche ad una comunità microbica

23 Ma la specie non è tutto.... All’interno di una medesima specie esiste una enorme diversità genetica e metabolica, legata a presenza di elementi di DNA mobile (plasmidi e altri) o a semplici mutazioni puntiformi Es: isolati di Escherichia coli in grado di produrre particolari strutture extracellulari

24 Le tecniche molecolari

25 ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA COMUNITA’ MICROBICA
ESTRAZIONE DNA DAL CAMPIONE AMBIENTALE AMPLIFICAZIONE PER PCR DI UN FRAMMENTO DEL GENE 16s rRNA ANALISI DIRETTA DELLA DIVERSITA’ DEL CAMPIONE (es. DGGE, T-RFLP)

26 16S RNA RIBOSOMIALE Struttura primaria e secondaria dell’ rRNA 16S di E.coli

27 Identificazione molecolare dei componenti di una comunità microbica
Primer usati per la PCR: 16S RNA (per Bacteria) rRNAs (universale) Per microrganismi eucarioti: 18S RNA ITS (internal transcribed spacer) DNA ambientale o da coltura Prodotti di PCR da analisi di campioni ambientali analizzati su gel d’agarosio non denaturante Specifiche bande possono essere estratte e sequenziate I frammenti vengono separati in condizioni denaturanti (generalmente gradiente di urea)

28 La DGGE è un importante tool sperimentale
Tempo (sett.): Aggiunta benzoato Monitoraggio di microrganismi in grado di degradare composti aromatici in un modello sperimentale di crescita in suoli contaminati e non.

29 Appl Environ Microbiol. 2000
23CAT-F 5′-CGACCTGATCTCCATGACCGA-3′ 23CAT-R 5′-TCAGGTCAGCACGGTCA-3′ DEG-F 5′-CGACCTGATC(AT)(CG)CATGACCGA-3′ DEG-R 5′-T(CT)AGGTCA(GT)(AC)ACGGTCA-3′ Mesarch et al. Appl Environ Microbiol. 2000 Detection of 238-bp dioxygenase amplicons by PCR and hybridization using primers DEG-F and DEG-R. Lane M, 100- to 3,000-bp marker (Bio-Rad); lanes 1 to 8, P. putida HS1, P. putida mt-2, P. aeruginosa JI104, Pseudomonas sp. strain IC, P. putida P35X, Pseudomonas sp. strain CF600, P. putida H, and Pseudomonas sp. strain PpG7, respectively. Agarose gel (1.5% agarose) of the amplicons with approximately equal amounts of DNA in each lane

30 Tre problemi nella definizione dell’ecologia microbica di un determinato (micro)ambiente
Definizione di specie nell’ambito microbico (OTU) Capacità di “vedere” i microrganismi, ivi inclusi i microrganismi VBNC Determinare da un punto di vista statistico il numero di specie (OTUs) che ci permette una definizione sufficientemente completa di un ambiente (Schloss and Handelsmann, Ann. Rev. Micro. 2007)

31 Stima della biodiversità (curve di rarefazione)
Raccolta dati (screening dei cloni ottenuti) STIMA BIODIVERSITA’ % di differenza nella sequenza del gene marker (es. 16S RNA

32 Perché la definizione precisa della biodiversità è così importante?
Correlare presenza di specie ad attività biologica di interesse (biorisanamento, produzione di molecole di interesse) Confrontare ambienti simili, ma di diversa provenienza, in termini di composizione microbica, per prevederne le caratteristiche Problema metodologico: significatività statistica del campione in esame

33 Un problema simile: uso delle parole in libri di un determinato autore (the book model)
On the Origin of Species The Descent of Man The Voyage of the Beagle The Adventures of Huckleberry Finn The Adventures of Tom Sawyer The Portrait of a Lady Goodnight Moon n1 The (10,196) The (22,164) The (16,924) And (6228) The (3681) The (8449) Goodnight (20) n2 Of (7396) Of (12,304) Of (9429) The (4771) And (3000) To (7469) And (17) n3 And (4387) In (7547) And (5765) I (3210) A (1795) Of (6592) A (10) n4 In (3920) And (7342) A (5325) To (2914) To (1705) A (5485) The (6) n5 To (3567) To (5743) In (4288) A (2911) Of (1446) She (4772) Little (4) n6 A (2473) A (4412) To (4091) It (2279) He (1181) And (4504) Of (3) n7 That (2059) That (3529) Is (2413) Was (2063) Was (1166) Her (4480) Moon (3) n8 Have (1760) Is (3237) It (1998) He (1667) It (1116) I (4076) 20 words used twice n9 Be (1655) As (3134) That (1940) Of (1641) In (937) That (3735) n10 As (1579) Are (2522) On (1868) In (1428) That (890) You (3735) ST 7426 14,557 12,726 7263 8111 12,427 55 NT 150,951 272,296 205,424 110,271 70,030 230,485 151 St: numero totale di singole parole utilizzate Nt: numero totale di parole nel libro

34 Annual Reviews

35 Confronto di comunità microbiche nei suoli dell’Alaska (a-b) e del Minnesota (c-d)
Annual Reviews

36 pyrosequencing