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Analisi microbiologica dei campioni Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: 1 ml Sospensione di terreno 1 2 3 4 5 6 7 8 10.

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1 Analisi microbiologica dei campioni Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: 1 ml Sospensione di terreno Conte dirette al microscopio ottico o allepifluorescenza o elettronico a scansione Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo Tecnica del vetrino interrato Se la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo Valori in difetto Valori in eccesso Metodi di rilevamento 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo 1

2 Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa volte superiore. Colorazioni vitali Permettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle che non metabolizzano più. Conte dirette I valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte 2

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4 4

5 Hemolysis 5

6 Subito dopo linoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare. Si divide la piastra in spicchi, uno per ciascun antibiotico, e si deposita al centro di ogni spicchio il dischetto corrispondente, con laiuto di una pinzetta sterile. Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per ore. Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico. 6

7 Sospensione e serie delle diluizioni c) Sterilizzare alcune provette vuote da 22mm per le diluizioni a) Preparare 500 ml di soluzione fisiologica (NaCl 9 in H 2 O deionizzata). Distribuire come al punto b e versare il rimanente in una beuta da 1000 ml, sterilizzare b) Preparare una beuta da 250 ml con 95 ml di soluzione fisiologica, alla quale si aggiungano circa 100 palline di vetro, sterilizzare 1) Preparazione del materiale 7

8 a) Prelevare 5 grammi dal campione mediato e metterli nella beuta sterile contenente la soluzione fisiologica e le palline di vetro. In questo modo si ottiene la diluizione ) Sospensione del campione e diluizioni seriali b) Mettere la beuta ad agitare per 15 minuti d) Fare le diluizioni: prelevare 1 ml di soluzione dalla beuta di partenza (diluizione10 -1 ) e metterlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica; procedere in successione fino ad ottenere la diluizione ml 9 ml Diluizioni seriali c) Distribuire sterilmente 9 ml di soluzione fisiologica in 5 provette sterili 9 ml 8

9 3) Conta su piastra d) Incubare a 28°C per circa una settimana; procedere con la conta delle colonie cresciute sulle piastre inoculate e registrare i dati raccolti per la successiva elaborazione a) Per i funghi, dalle diluizioni 10 -2, 10 -3, 10 -4, prelevare sterilmente 0,1 ml, versarlo sulla piastra e spargere la coltura con un'ansa sterile b) Per i batteri, procedere allo stesso modo ma considerare le diluizioni 10 -3, 10 -4, ; c) Inoculare 3 piastre per ciascuna diluizione, sia per la conta dei funghi che per la conta dei batteri N.B. Ricordarsi di indicare su ciascuna piastra il tipo di terreno utilizzato specifico per batteri o funghi, il campione, la diluizione e la data. Aggiungere una o due piastre di controllo per ciascun terreno, inoculate con soluzione fisiologica sterile 9

10 Dosaggio di proteine in una coltura batterica Lowry et al. (1951) Preparazione del materiale Soluzioni NaOH 1 N NaOH 0,1 N Na 2 CO 3 2% in NaOH 0,1 N CuSO 4 5H 2 O 1% in H 2 O distillata Tartrato di sodio 2% in H 2 O distillata o potassio Prima di procedere al dosaggio delle proteine in una coltura batterica è necessario disegnare su carta millimetrata la curva di taratura utilizzando una soluzione a concentrazione nota di Albumina Assorbanza g/ml proteine 5. Ciclo dellazoto Analisi di attività batteriche 10

11 Idrolizzare i campioni nel modo seguente: centrifugare per 20 minuti a giri/min 3 ml di coltura batterica risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo in una provetta di vetro; chiudere ciascuna provetta con carta dalluminio mettere le provette a bollire per 10 minuti 11

12 preparare la miscela di reazione nella quantità necessaria, mescolando con le seguenti proporzioni le soluzioni: Na 2 CO 3 10 ml CuSO 4 5 H 2 O0,1 ml Tartrato di sodio o potassio 0,1 ml prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in unaltra provetta aggiungere 4 ml della miscela di reazione lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine: 12

13 valutare la quantità di proteine dei campioni dalla curva di taratura N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta contro un bianco (H 2 O) sottoposto alle stesse reazioni del campione leggere lassorbanza allo spettrofotometro ad una lunghezza donda di 500 nm Assorbanza g/ml proteine 13

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15 Controllo dello sviluppo microbico controllo dello sviluppo microbicoPer controllo dello sviluppo microbico si possono intendere diverse cose: si può volere inibire e non uccidere i microrganismi, oppure si vuole eliminare totalmente la popolazione microbica su soggetti inanimati o su superfici viventi. Si usano diversi metodi e diverse terminologie ne indicano le finalità. 15

16 Controllo dello sviluppo microbico Sterilizzazione:Sterilizzazione: è il processo in cui vengono distrutte o rimosse tutte le cellule viventi (includendo le spore, i virus e i viroidi) da un determinato habitat o da oggetti inanimati; Disinfezione:Disinfezione: uccisione o inibizione di soli microrganismi patogeni e disinfettanti sono gli agenti chimici che vengono usati nei processi di disinfezione; Sanificazione:Sanificazione: la carica microbica viene ridotta entro limiti considerati sicuri per gli standard di sanità pubblica; 16

17 Controllo dello sviluppo microbico Antisepsi:Antisepsi: è la pratica in grado di prevenire una infezione e si dicono antisettici i composti chimici utilizzati; Antibiotici e chemioterapici:Antibiotici e chemioterapici: rientrano nelle categorie dei composti in grado di controllare lo sviluppo microbico. 17

18 Il modello di morte microbica La distruzione di una popolazione microbica non avviene istantaneamente con lesposizione ad un agente letale. Dopo che la popolazione ha subito una marcata riduzione, il tasso di mortalità rallenta e ciò consente la sopravvivenza di ceppi microbici più resistenti. E molto difficile stabilire il punto di morte dei microrganismi: quando avviene? Generalmente quando una cellula, inoculata in brodo fresco, non dà più origine ad una progenie. 18

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26 ….by manu!!! 26

27 MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE CLASSICHE E MOLECOLARI 27

28 Diversità morfologica dei microrganismi MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO 28

29 Monotrico Anfitrico Lofotrico Peritrico Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula Flagello/i: non visibile al microscopio!!! Diversità morfologica dei microrganismi MORFOLOGIA CELLULARE 29

30 Microscopia ottica ed elettronica MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate allosservazione di organismi microscopici 30

31 Microscopia ottica ed elettronica 31

32 Microscopia ottica ed elettronica Fonte luminosa Campione Obiettivo Oculare Fascio di elettroni Campione Lente magnetica Lente obiettivo Lente proiettore Immagine schermo fluorescente Microscopia ottica Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 32

33 Concetti chiave 1.Ingrandimento. 2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. - occhio umano m; - microscopio ottico: 0.2 m (200 nm); - microscopio elettronico: nm. Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce-fascio di elettroni). Microscopia ottica ed elettronica 33

34 Schema: microscopio composto Tubo metallico OCULARE- GENERALMENTE BINOCULARE !! OBIETTIVO 10X OBIETTIVO 40X OBIETTIVO 100X Ganci Condensatore Diaframma Sorgente di luce Braccio Tavolino Porta campione Vite macrometrica Vite micrometrica MESSA A FUOCO Base microscopio Ruota obiettivi 34

35 Principi di base: microscopio composto Sistema di lenti convergenti: 1.Oculare ed 2. Obiettivo allestremità di un tubo metallico (160 mm) -Campione (oggetto) davanti l obiettivo immagine reale-capovolta ed ingrandita - Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti alloculare immagine virtuale, capovolta ed ingrandita 35

36 Principi di base: microscopio composto OBIETTIVO ED OCULARE LAVORANO INSIEME PER RISOLVERE LIMMAGINE Loculare risolve limmagine reale risolta dallobbiettivo 10X oculare 10X, 40X,100X obiettivi INGRANDIMENTO FISSO Ingrandimento totale= Ingr. oculare X Ingr. obiettivo 36

37 Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione - Lobiettivo 100X è sempre ad immersione; - Lobiettivo 100X è retrattatile; - Lolio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dellobiettivo. 37

38 Osservazione in vivo e le colorazioni 1.Osservazione in vivo: - vetrino + goccia campione+ coprioggetto; - vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto; - vetrino + goccia campione+ coprioggetto. 2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità per specifiche componenti cellulari. Distinguiamo : A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e polisaccaridi acidi, COO - ] : blu di metilene, safranina e cristal violetto. B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture cellulari citoplasmatiche]. Eosina, Rosso congo, Fucsina acida. 38

39 Esami in laboratorio Esami colturali Colorazione di Gram Colorazione di Gram Biologia molecolare (?) 39

40 Colorazione di Gram Fasi della colorazione Struttura della parete Gram-positivi Gram-negativi 40

41 agar McConkey (Enterobatteri) agar sangue (G. vaginalis) agar cioccolato (Gonococco) agar sale mannite (Stafilococchi) agar sangue (Streptococchi ) Esame colturale per batteri Gram-positivi Gram-negativi 41

42 Colorazione di Gram 1884 Hans Christian Gram -Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare 42

43 Gallerie API 20 E Gallerie API 20 NE Gallerie API NH Prove biochimiche: TSI agar Indolo e/o Mobilità in SIM agar Identificazione microbica Batteri Gram-negativi 43

44 Gallerie API Staph (bioMérieux) Identificazione microbica Staphylococcus aureus Mannite+ e Coagulasi+ Test coagulasi Test catalasi 44

45 (Incubazione a 37° per 2-5 gg) Lieviti: esame colturale Sabouraud dextrosio agar 45

46 Colorazione di Gram Asciugare allaria Fissare alla fiamma RISULTATO AL MICROSCOPIO? 46

47 Colorazione di Gram Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi? 47

48 Colorazione di Gram 48

49 ma …ma… La colorazione di GRAM è molto utilizzata in microbiologia clinica, ma poco sfruttabile in microbiologia ambientale 49

50 Microscopia ad epifluorescenza DAPI SYBR-GREEN Labels double DNA strain A simple-to-use fluorescent stain, 4',6- diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. (a)and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom (b) culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture (c)at time zero. Upper panel magnification was ×, lower panel (d) magnification was ×. 50

51 COLTURE DI MICRORGANISMI La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto. Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente. 51

52 Colture di microrganismi RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE DELLAMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE, LATTIVITà ANCHE AL FINE PER APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE. 52

53 MEZZI (TERRENI) DI COLTURA solidoliquido 53

54 TERRENI DI COLTURA Terreni sintetici o definiti : COMPOSIZIONE ESATTA Terreni complessi : COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc… Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi, nucleotidim vitamine Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali per il metabolismo cellulare. Terreni selettivi Terreni differenziali Terreni di arricchimento 54

55 MEZZI (TERRENI) DI COLTURA The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but does not ferment mannitol. Esempio di Terreno selettivo: MANNITOL SALT AGAR Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae; 55

56 TERRENO DI COLTURA: differenziale Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi. 24 h at 35°C Shigella flexneri Inibito dall acetato. Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi. 24h a 35 °C Sodium Chloride5.0gm Sodium Acetate2.0gm Monoammonium Phosphate 1.0gm Dipotassium Phosphate 1.0gm Magnesium Sulfate0.1gm Bromothymol Blue0.08gm Agar20.0gm Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C. 56

57 Diversità morfologica dei microrganismi DIVERSITA MORFOLOGICA DELLE COLONIE IMPORTANZA DEI PIGMENTI E DEI MARGINI DELLE COLONIE 57

58 PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE 58

59 DIVERSITà METABOLICA DALLA COLONIA Test biochimici identificativi 59

60 DIVERSITà METABOLICA 60

61 LA COLONNA DI WINOGRADSKY 61

62 SCHEMA di una colonna Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce 62

63 GRADIENTE PAROLA CHIAVE: GRADIENTE - DI OSSIGENO - DI LUCE - DI NUTRIENTI (per es ZOLFO) 63

64 CONTA DEI MICRORGANISMI A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the dilution. This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10 -7, 10 -8, and dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates. 64

65 CONTA DEI MICRORGANISMI DAPI, syber green, arancio di acridini Sono colaranti utilizzati anche nella conta di microganismi mediante Microscopia a fluorescenza 65

66 MISURA DELLATTIVITà DEI MICROORGANISMI RESPIRAZIONE Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added through the CO 2 absorber in the tube on top of the main flask. During incubation the CO 2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube. This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO 2 More air can be added and the alkali replaced to continue the process of analysis. 66

67 MISURA DELLATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI 67

68 METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI -Ricavano energia dallossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio CH O > CO H 2 O + energy - enzima chiave metano-ossigenasi 68

69 Struttura primaria e secondaria dell rRNA 16S di E.coli 16S RNA RIBOSOMIALE 69

70 PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE CFU_ colony- forming unit Unità formante colonia Biolog_example of commercial kit PLFA: phospholipids fatty acid profile FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique IS-PCR Intergenic Spacer- Polymerase Chain reaction 70

71 PLFA: phospholipids fatty acid profile PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms 71

72 reazione di polimerizzazione a catena REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR) Esempi di utilità della PCR : 1.Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie, genere,,etcc (microbiologia clinica) 2.Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente oligotrofico) 72

73 COMPONENTI TEMPERATURA REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR) 73

74 REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR) 74

75 AGAROSIO PERCENTUALE dipendente dalla lunghezza del frammento da caricare EBOLLIZIONE (microonde) PREPARAZIONE Cassetta versamentodel gel nella cassetta ELETTROFORESI 75

76 ELETTROFORESI CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer) CORSA TRA ELETTRODI 76

77 Risultati PCR su gel

78 NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO 78

79 NUOVE TECNICHE: molecolari 79

80 Microscopio ad epifluorescenza 80

81 Microscopio ad epifluorescenza Schema sorgente di luce 1. Globo di quarzo 2. e 3. Catodo e Anodo 4. Camera di combustione (contenente Hg) 5. Arco voltaico 365 nm linee del mercurio 81

82 colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza donda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza [4',6-diamidino-2-phenylindole ] CampioneDAPI + Microscopio a fluorescenza le colorazioni in Ecologia microbica 82

83 Microscopio ad epifluorescenza: immagini DAPI SYBR-GREEN 83

84 Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization) 84

85 Microscopio ad epifluorescenza e FISH 85

86 MICROSCOPIO CONFOCALE 86

87 MICROSCOPIO CONFOCALE Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione. Intensità luminosa Segnale elettrico Digitalizzazione 1 punto = 1 pixel Specchio dicroico Coerenza-Alta intensità-Unica λ 87

88 MICROSCOPIO CONFOCALE Spostamento verticale della sezione ottica Sovrapposizione singoli pianiRicostruzione 3D 88

89 Microbiologia : analisi delle acque - Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento 89

90 - Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici) - Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia intestinalis) - Dai risultati delle analisi Punteggio Livelli di inquinamento ParametroLivello 1Livello 2Livello 3Livello 4Livello OD( % sat) >10<20<30<50>50 BOD 5 (O 2 mg/L) < 2.5<4<8<15>15 COD (O 2 mg/L)<5<10<15<25>25 NH 4 (N mg/L)<0.03<0.10<0.50<1.5>1.5 NO 3 (N mg/L)<0.3<1.5<5.0<10.0> 10 P (mg/L)<0.07<0.15<0.3<0.6>0.6 Escherichia coli (UFC/100 ml) <100>1.000< 5.000<20.000> Punteggio Microbiologia : analisi delle acque 90

91 Microbiologia : analisi delle acque - Conta dei coliformi totali (UFC/ml) - Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) - Conta delgi Streptococchi fecali TERRENO DI COLTURA T° INC.TEMPO INC. CONTA BATTERICA TOTALE PCA (Plate Agar Count) 22°C 36°C 72h 48h COLIFORMI TOTALI Membrane endo agar less 36°C24h COLIFORMI FECALI Membrane faecal coliform 44°C24h STREPTOCOCCHI FECALI KF streptococcus36°C48h 91

92 Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si cercano -Coliforme: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae. - Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti -Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni - Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp. -Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro Escherichia coli…. - Escherichia coli…. 92

93 Microbiologia : Coliformi fecali - Sinonimo di Coliformi termoresistenti - Fermentano il lattosio a °C 93

94 Microbiologia : Streptococchi fecali - Gram positivi - Indicatori di inquinamento non recente (vita media>) - Terreno KF - Sodio azide (inibitore di altri microrganismi) - Colonie rosse con alone chiaro attorno 94

95 Microbiologia : Streptococchi fecali - Chi sono e come si cercano SpeciesColonia rossaAlone giallo Enterococcus faecalis ++ Enterococcus hirae + (poor)+ Enterococcus equinus + (poor)+ Streptococcus pyogenes -- Streptococcus agalactiae-- Lactobacillus plantarum -- Escherichia coli Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa 95

96 Microbiologia : metodo delle membrane filtranti Metodo delle membrane filtranti N Colonie /100 ml = N (colonie contate) / volume (campione filtrato) X100 96


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