I virus Un virus e’ una nucleoproteina che si moltiplica e che ha l’abilita’ di causare malattie Il numero totale di virus conosciuto a tutt’oggi raggiunge.

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1 I virus Un virus e’ una nucleoproteina che si moltiplica e che ha l’abilita’ di causare malattie Il numero totale di virus conosciuto a tutt’oggi raggiunge le 2000 “specie” Un virus puo’ infettare una o dozzine di differenti specie di piante e ogni pianta puo’ essere attaccata da differenti virus Benche’ i virus possano assumere diverse forme sono sostanzialmente a forma bastoncellare, poliedrica o varianti di queste forme I virus non si dividono e non producono nessun tipo di strutture specializzate di riproduzione (spore..) I virus causano una malattia attraverso la semplice occupazione degli spazi, l’uso di sostanze cellulari durante la riproduzione e alterando I processi cellulari I virus vegetali sono molto diversi da tutti gli altri patogeni delle piante non solo in taglia e forma ma anche nella semplicita’ della loro costituzione chimica, della struttura, dei metodi di infezione, moltiplicazione, traslocazione all’interno dell’ospite, disseminazione e sintomi prodotti E’ molto difficile diagnosticare la presenza di virus, molto spesso si formano per’ delle vere e proprie inclusioni cellulari che consistono di particelle virali visibili al microscopio ottico

2 Detection dei virus vegetali
Le cellule delle giovani foglie vegetali infettate da virus mostrano corpi di inclusione che consistono di aggregati virali Esaminando le sezioni di cellule infettate da virus al microscopio elettronico rivela dettagli dell’arrangiamento del virus all’interno di corpi d’inclusione Attualmente solo pochi sintomi possono essere associati con certezza a infezioni da virus, come il pattern a “foglia di quercia”, macchie anulari clorotiche e necrotiche Molti altri sintomi indotti da virus assomigliano a quelli indotti da mutazioni, deficienze nutrizionali, tossicita’ ambientale, danni da insetti

3 Detection dei virus vegetali

4 Detection dei virus vegetali
I metodi per rilevare I virus vegetali coinvolgono principalmente la trasmissione dei virus da una pianta malata a una sana per innesto o grattando le foglie di piante sane con il fluido cellulare di piante malate Il metodo migliore per rilevare un virus e’ dato dalla purificazione, la microscopia elettronica e la sierologia Inoltre negli ultimi 5-10 anni e’ aumentato l’uso di sonde a RNA o DNA per amplificare il genoma virale

5 Morfologia dei virus vegetali
I virus vegetali possono essere di diverse forme e taglie Piu’ della meta’ sono allungati (bastoncellari, A-B; A2) e altrettanti sono sferici (isometrici o poliedrici, D) con I rimanenti che sono cilindrici e bacilliformi (C) Alcuni virus sono bastoncelli rigidi di circa nm In sezione trasversale i virus bastoncellari appaiono come tubi vuoti in cui le proteine formano le pareti e gli acidi nucleici sono intercalati sempre spiralmente tra 2 subunita’ proteiche

6 Morfologia dei virus vegetali
Molti virus hanno dei genomi divisi, cioe consistenti di 2 o piu’ filamenti di acidi nucleici incapsidati in particelle di diversa taglia fatte delle stress subunita’ proteiche (E2) Nei virus “multicomponenti” tutte le parti di acidi nucleici devono essere presenti contemporaneamente nella pianta per poter provocare la malattia La superficie dei virus consiste di un definito numero di subunita’ proteiche, che sono sistemate a spirale nei virus allungati e compattate sulla superficie dei virus sferici I rabdovirus (D2) sono corti, bacilliformi, bastoncellari cilindrici lunghi nm e dotati di una membrana lipoproteica esterna La maggior parte dei virus sferici sono realmente poliedrici con un diametro di nm

7 Composizione e struttura
Ogni virus consiste al minimo di un acido nucleico e un tipo di proteina Alcuni virus consistono di piu’ tipi di acidi nucleici e di proteine e altri hanno enzimi o lipidi Gli acidi nucleici costituiscono dal 5 al 40 % del virus mentre le proteine fanno il resto Il genoma virale e’ abbastanza piccolo (1-3x106 Da) se comparato a quello dei batteri (1.5x109 Da) La parte proteica e’ composta di subunita’ ripetute, la cui composizione aminoacidica varia da virus a virus e anche all’interno dello stesso tipo virale La subunita’ proteica di TMV consiste di 158 AA in una sequenza costante con una massa di 17.6 Kd Ogni particella di TMV consiste di circa 130 giri d’elica di subunita’ proteiche, tra cui e’ “impacchettato” il genoma La maggior parte dei virus vegetali e’ a RNA ma ci sono esempi anche di virus a DNA (su 1000; 800 a ssRNA, dsRNA, 110 ssDNA e 80 dsDNA) Esistono poi dei virus (satellite) che non sono in grado di replicarsi da soli nell’ospite ma hanno bisogno di un virus helper, di cui pero’ spesso ne causano il rallentamento della replicazione Sono stati trovati anche deigli RNA satellite all’interno di virioni di virus multicomponenti

8 Genoma virale Il capside proteico virale non e’ solo un contenitore di acidi nucleici ma gioca un ruolo imporatnte nel determinare la trasmissibilita’ virale, infatti la sua presenza aumenta l’infettivita’ del virus Alcuni virus hanno nel loro genoma una trascrittasi che serve per la loro moltiplicazione e infezione La capacita’ del RNA virale di riprodursi indica che nell’RNA stesso ci sono tutti I determinanti genetici del virus In alcuni virus la quantita’ di acidi nucleici a disposizione e’ aumentata dal fatto che la sequenza codificante di alcuni geni e’ sovrapposta con quella di altri Il numero di basi usati per la sintesi delle subunita’ proteiche del capside e’ solo una piccola parte del genoma virale (158 bp contro 2130 in TMV) La parte rimanente di genoma serve per codificare RNA polimerasi, altre proteine strutturali, di movimento, di interazione con il vettore, nucleasi e altre per produrre I corpi di inclusione

9 Genomi monopartiti e bipartiti

10 Replicazione virale- ssRNA
I virus entrano nelle piante attarverso ferite meccaniche o fatte da vettori L’RNA del virus si libera del capside proteico e poi utilizza la cellula ospite per replicare la sua RNA polimerasi Questo enzima utilizza l’RNA virale come stampo per formare dell’RNA complementare Il primo RNA prodotto non e’ l’RNA virale ma un RNA “specchio” che rimane temporaneamente connesso con l’RNA di partenza Si ha quindi la formazione di un dsRNA che presto si separa a produrre una copia dell’RNA virale e un’altra di RNA specchio (-) che serve come templato per la replicazione degli altri nuovi filamenti

11 Replicazione virale- dsDNA
Il virus a dsDNA entra nel nucleo della cellula vegetale dove appare in forma supercoiled e forma un minicromosoma Questo viene trascritto in 2 ssRNAs: Il piu’ piccolo e’ trasportato nel citoplasma dove e’ tradotto in proteine virali Anche quello piu’ grande viene trasportato nel citoplasma ma diventa incapsidato con le subunita’ proteiche ed e’ usato come templato per una trascrizione inversa per formare un completo virione di ssDNA L’ssDNA si replica formando un filamento multimerico che serve come stampo per la formazione di altri filamenti multimerici che sono poi tagliati a produrre filamenti unici Appena il DNA virale viene sintetizzato induce la cellula ospite a “leggerlo” per produrre le proteine del capside

12 Infezione e biosintesi virale
La sintesi delle proteine virali avviene garzie al ruolo di mRNA svolto dall’RNA virale Il virus utilizza gli AA, i ribosomi e il tRNA dell’ospite L’RNA replicato e le proteine prodotte sono ad uso esclusivo del virus Non appena si producono le proteine del capside queste si associano con l’acido nucleico e si forma un virus completo I primi virioni intatti compaiono nelle cellule 10 ore dopo l’infezione

13 Traslocazione dei virus
Quando un virus infetta una pianta si muove da una cellula all’altra e si moltiplica in tutte le cellule I virus si muovono attraverso I plasmodesmi moltiplicandosi nelle cellule parenchimatiche Nelle cellule fogliari I virus si muovono di circa 1 mm (8-10 cellule) al giorno Molti virus comunque richiedono 2-5 giorni per uscire da una foglia infetta I virus raggiungono il floema e da qui vengono rapidamente trasportati verso I meristemi apicali Nel floema I virus infettano la pianta a livello sistemico rientrando nelle cellule parenchimatiche adiacenti ai tubi cribrosi I virus a mosaico infettano tutti I tessuti della pianta e ogni cellula vegetale infettata puo’ contenere anche 10 milioni di particelle virali

14 Le proteine di movimento
I virus si propagano attarverso I plasmodesmi che sono una sorta di canalicoli di circa 50 nm di diametro. Le loro pareti sono “tappezzate” dalla membrana plamsatica, mentre la cavita’ centrale e occupata da una duplice membrana di RE cui e’ addossata una seri di proteine. Il lume del plasmodesma e’ ridotto a 4-5 canalicoli di 2-3 nm di diametro, che consentono il passaggio di molecole di raggio non superiore a 1 nm e peso molecolare di 1 Kd e quindi hano unlimite di esclusione ben superiore al diametro delle particllle virali (3-90 nm)o dei loro acidi nucleici liberi (3-5 nm) Esistono pero’ plasmodesmi con limiti di esclusione diversi. Ad esempio nei tricomi il diametro e’ di 4nm (7Kd) e altri che collegano le cellule compagne con I tubi cricrosi di 6nm (25Kd) Per avere ragione di tali barriere dimensionali, insuperabili nel caso delle cellule parenchimatiche, I fitovirus hanno sviluppato strategie di trasporto I cui agenti saono le cosiddette proteine di trasporto o di movimento Queste proteine non strutturali (non sono parte intergrante delle particelle virali) sono codificate dal genoma del 75% dei taxa virali noti e regolano il passaggio intercellulare delle unita’ infettive interagendo cn I plasmodesmi Nelle piante esistono proteine endogene non virali che regolano il traffico macromolecolare intercellulare agendo proprio sui plasmodesmi E’ possibile che queste proteine costituiscano I fattori dell’ospite di cui e’ stata ipotizzata la collaborazione con le proteine virali di movimento

15 Le proteine di movimento
Le proteine di trasporto note sono rapportabili a 4 principali raggruppamenti Proteine della superfamiglia 30K Proteine del triplo blocco Proteine ricche in prolina Altri tipi di proteine

16 La superfamiglia 30K E’ costituita da proteine di dimensioni variabili tra 22 e 50 Kd e contengono un motivo conservato di 30 AA Sono state identificate nei seguenti taxa ssRNA (+) virus: tobamovirus, tobravirusAlfamovirus, Comovirus e molti altri ssRNA (-) virus: tospovirus dsDNA virus: Caulimovirus, Badnavirus ssDNA virus: geninivirus La proteina meglio studiata e’ la 30K di TMV che svolge le seguenti funzioni: Aumenta la permeabilita’ dei plasmodesmi portando il limite di esclusione da 1,5 fino a 9 nm Favorisce il dispiegamento dell’RNA virale linearizzandone la molecola Si lega all’RNA virale formando complessi di 3-5 nm di diametro Accompagna l’RNA virale attraversando I plasmodesmi come parte del complesso di trasporto Protegge l’RNA virale dall’attivita’ nucleolitica delle cellule dell’ospite Indica la direzione del trasporto attraverso segnali di localizzazione plasmodesmica Le proteine 30K-simili sono state individuate nel canale dei plasmodesmi, nella parete cellulare in prossimita’ dei plasmodesmi delle cellule infette, in associazione col reticolo endoplasmatico e col citoscheletro

17 Tipi di trasporto mediati dalle 30K
Tipo Tobamovirus (TMV) Trasporto di complessi nucleoproteici infettivi subvirali costituiti da RNA genomico e proteina 30K, attraverso plasmodesmi temporaneamente modificati dalla proteina 30K stessa. Tale processo si svolge in 4 fasi Formazione di un complesso nucleoproteico (RNA linearizzato-30K) attraverso meccanismi analoghi a quelli operati dalle chaperonine (omoogia di seuqenza tra 30 K e HSP90) Specifico avvio del complesso nucleoproteico verso I plasmodesmi con il coinvolgimento di un peptide segnale target per il plasmodesma. Queste sequenze potrebbero interagire con le shuttle protein dell’ospite che servono a indirizzare le macromolecole verso il plasmodesma Interazione della proteina di trasporto con le strutture che regolano il plasmodesma al fine di aumentare la permeabilita’ del canale (reazioni fosforilazione/defosforilazione) Traslocazione del complesso NP attraverso I plasmodesmi con passaggio dell’intero complesso nella cellula contigua, ovvero passaggio del solo RNA virale e modificazione permanente della permeabilita del plasmodesma da parte delle proteine di trasporto che si legano alle subunita’ strutturali del canale Tipo Alfamovirus Trasporto di un complesso NP subvirale costituito da AN+PM+P. del capside Tipo Comovirus e CPMV Trasporto di virioni interi contenuti nei tubuli formati dalle proteine 45K (nepovirus) o 48K (comovirus) a seguito di modificazione irreversibile dei plasmodesmi con rimozione delle strutture interne Tipo misto Caso del CaMV. Nelle fasi iniziali dell’infezione il trasporto avviene come in TMV e in quella tardiva come CPMV

18 Proteine del triplo blocco
Sono proteine espresse da un gruppo di 3 piccoli geni contigui che codificano 2 proteine con affinita’ di membrana ed 1 con RNA elicasi La delezione di una qualunque delle 3 proteine fa perdere la capacita’ di movimento al virus Proteine ricche in prolina Nei Tymovirus la funzione di movimento e’ esercitata da una proteina ricca in prolina di 75 Kd che ha una qualche omologia con l’estensina, una proteina associata alla parete cellulare Altri tipi di proteine Tutti I membri dei generi della famiglia delle Closteroviridae codificano polipeptidi correlati alle proteine da shock termico (HSP70) che pur non essendo delle vere e proprie proteine di trasporto potrebbero essere coinvole nel trafserimento di RNA virale verso e attraverso I plasmodesmi (funzione di accompagnamento), interagendo col citoscheletro ed utilizzando I meccanismi di traslocazione cellulare

19 Sintomi locali Tutti le malattie virali sembrano causare nanismo o appassimento della pianta intera e la riduzione della produttivita’ In molte piante inoculate artificialmente con alcuni virus si ha la comparsa di piccole lesioni clorotiche o necrotiche soltanto nei punti di inoculo (lesioni locali) Molti virus infettano I loro ospiti senza causare lo sviluppo di alcun sintomo visibile Tali virus sono chiamati latenti e fli ospiti come portatori asintomatici In altri casi piante che sviluppano i sintomi dell’infezione possono, se infettate da certi tipi d virus, essere temporaneamente senza sintomi in certe condizioni ambientali (alte o basse T) (sintomi mascherati)

20 Sintomi sistemici Le piante possono mostrare sintomi acuti e severi subito dopo l’infezione che possono portare a morte di rami giovani o dell’intera pianta Se l’ospite sopravvive all’infezione puo’ mostrare sintomi cronici che possono essere recuperati In altri casi questo stato cronico porta a deperimento la pianta intera I tipi di sintomi piu’ comunemente registrati nelle infezioni virali sono I mosaici o le macchie anulari (mosaics and ring spots) I mosaici sono caratterizzati da aree verde-pallido, gialle o bianche intervallate con aree normali su foglie, fiori e frutti I ring spots sono caratterizzati dalla comparsa di anelli clorotici o necrotici sulle foglie e qualche vlta su fusto e frutti

21 Fisiologia delle piante infettate da virus
I virus vegetali non contengono nessun enzima, tossine o altre sostanze patogeniche ma ciononostante riescono a indurre molti sintomi diversi nell’ospite La semplice presenza del virus stesso, anche in grandi quantita’, non basta a spiegarli Le malattie virali non sono dovute principalmente ad una deplezione dei nutrienti che sono stati deviati verso la sintesi del virus stesso, ma piuttosto a effetti indietti che il virus ha sul metabolismo dell’ospite Questi effetti sono indotti probabilmente dalla sintesi, indotta da virus, di nuove proteine alcune delle quali sono biologicamente attive (enzimi.) e possono interferire con il normale metabolismo dell’ospite I virus generalmente causano un decremento del tasso fotosintetico attraverso un’alterazione della quantita’ di clorofilla, dell’efficienza della clorofilla stessa e dell’area fogliare I virus usualmente causano un decremento delle sostanze ormonali attraverso l’induzione della produzione di sostanze inibenti la crescita Un decremento nell’azoto solubile durante la sintesi rapida di virus e’ abbastanza comune e in particolare nei virus a mosaico c’e una cronica deplezione dei livelli di carboidrati nei tessuti vegetali

22 Trasmissione dei virus vegetali
Includono: Propagazione vegetativa, attraverso I fluidi cellulari, I semi, il poline, insetti, nematodi e funghi Propagazione vegetativa Quando le piante vengono propagate per innesto, talea o attraverso tuberi, bulbi o rizomi e gli eventuali virus presenti nella pianta madre sono trasmessi alla progenie Per molti virus di alberi l’unico modo di penetrazione e’ il passaggio albero-albero attraverso gli innesti

23 Trasmissione attraverso i fluidi
La trasmissione meccanica attraverso puo’ avvenire per scambio di lufi cellulari (cell sap) tra piante malate e sane adiacenti dopo ferite dovute a vento forte oppure intere piante ferite durante le pratiche colturali o a causa degli erbivori (virus X della patata) Questo e’ il sistema migliore per causare un infezione sperimentale di una pianta sana e quindi e’ il mezzo piu’ usato per studiare gli effetti di un viruis Se l’inoculo e’ andato a buon fine il virus puo’ entrare attraverso le ferite o attraverso I peli fogliari rotti In un ospite infettato a livello sistemico I sintomi si evidenziano dopo giorni

24 Trasmissione attraverso contatto
Piu’ di 100 taxa virali sono trasmessi attraverso I semi, anche se di solito soltanto il 30% dei semi derivanti da piante virusate trasmettono alla progenie il virus I virus possono essere trasmessi attraverso il polline e possono indurre malformazioni nei frutti, possono infettare il seme e il seedling che si formano successivamente e in alcuni casi possono invadere, dal fiore fertilizzato, tutta la pianta madre (prunus necrotic ring spot virus)

25 Trasmissione attraverso insetti
Il principale metodo di trasmissione dei virus e’ attraverso gli insetti Pochi comunque sono gli insetti in grado di operare questa trasmissione Omotteri – afidi e cocciniglie Emitteri – coleotteri Ortotteri – cavallette Insetti con apparati boccali suggenti possono portare i virus all’interno dei loro stiletti e possono acquisire e inoculare il virus dopo pochi secondi a pochi minuti. Sono anche conosciuti come virus non persistenti Altri virus resistono all’interno di un vettore per pochi giorni (1-4) e sono chiamati semipersistenti Alcuni virus si accumulano all’interno dell’insetto e dopo il passaggio del virus attraverso i tessuti del vettore arrivano alle parti boccali e di nuovo nella pianta; questi virus prendono il nome di circolativi o persistenti Alcuni di questi virus possono moltiplicarsi all’interno dei loro rispettivi vettori vengono chiamati propagativi Gli afidi sono I piu’ importanti vettori virali e ne trasmettono la maggior parte (circa 275) attraverso il loro stiletto. Come regola diverse specie di afidi possono trasmettere lo stesso virus oppure la stessa specie di afide rasmette piu’ taxa virali Normalmente pero’ il rapporto virus-vettore e’ abbastanza specifico 55 virus a dsRNA come rabdovirus, piccoli virus isometrici e alcuni geminivirus sono trasmessi da cocciniglie

26 Epidemiologia L’isolamento (purificazione) dei virus si ottiene per ultracentrifugazione del fluido cellulare. 3 cicli alternati g-10000g g, consentono di separare il virus dai vari componenti cellulari La centrifugazione in gradiente di densita’ e’ un eccelente metodo per la separazione dei virus Quello che si ottiene e’ un precipitato di soli virus che possono essere usati per analisi in microscopia elettronica o per infezioni su piante test

27 Identificazione dei virus
L’ospite sul quale il virus induce I sintomi e il tipo di sintomi indotti sono d’aiuto per differenziare un virus da un altro Esperimenti di trasmissione sono utili per capire se il virus e’ trasmesso meccanicamente e verso quale ospite, o attraverso insetti e quali insetti Se il virus e’ trasmesso meccanicamente possono essere discriminanti alcune sue caratteristiche come Punto di inattivazione termica Longevita’ in vitro Diluizione minima a cui causa la malattia In alcune malattie (arboree) per identificare il virus si usa la tecnica dell’indexing che coinvolge un inoculo per innesto in alcune specie chiamate piante indicatrici Si possono usare anche test sierologici come il saggio ELISA con anticorpi monoclonali che riconoscono parti specifiche del virus, oppure per I dsRNA si puo’ banalmente eseguire un elettroforesi dell’RNA vegetale che non produce dsRNA L’RNA totale puo’ essere isolato da piante infette e mediante reazioni di RT-PCR produrre del cDNA e discriminare I vari taxa virali mediante un’ampificazione PCR usando inneschi taxa specifici NASBA Real Time PCR, il cDNA virale mette in evidenza attraverso la reazione di una sonda fluorescente che ne consente anche la quantizzazione

28 Nomenclatura e classificazione
Molti virus prendono il nome dal tipo di sintomo che provocano nell’ospite, ad es. Il TMV causa l’effetto mosaico sul tabacco Tutti I virus appartengono al regno dei virus e sono distinti in virus a RNA e a DNA, in quanto possono avere 1 o 2 filamenti (senso o antisenso) All’interno di questi gruppi vi sono I virus che si replicano mediante un enzima polimerasico (+RNA o DNA virus) o attraverso la RT (-RNA o DNA)

29 Controllo dei virus Il modo migliore per ottenere il controllo delle malattie virali e’ avere un’area “virus free” grazie a misure di quarantena, ispezioni e certificazioni L’esistenza di ospiti senza sintomi, il periodo di incubazione e l’assenza di sintomi evidenti in semi, tuberi e semenzali rende pero’ la quarantena difficile da applicare Le piante possono essere protette da certi virus facendo la lotta ai vettori Purtroppo molto spesso la lotta ai vettori e’ inefficace in quanto alcuni virus (come negli afidi) sopravvivono all’interno dell’ospite L’indexing periodico di alcune piante madre che producono organi riproduttivi come tuberi e bulbi e’ necessario Il breeding con specie virus-resistenti puo’ essere un valido mezzo per combattere le malattie virali In alcune malattie virali, la pianta puo’ essere “immunizzata” se trattata in precedenza con ceppi virali ipovirulenti (cross protection) Negli ultimi 10 anni sono state generate piante ingegnerizzate con frammenti di genoma virale. Queste piante trascrivono ed esprimono questi geni che in qualche modo interferiscono con la replicazione virale In molti casi la resistenza e’ dovuta al fenomeno del “gene silencing” che la pianta mette in atto attraverso gli small inhibitory RNA (siRNA) che sono in grado di bloccare la trascrizione di geni virali o esogeni Molti virus possono essere inattivati dal calore mediante immersione in acqua calda (35-54C) Non esistono sostanze chimiche (viricidi) anche se la ribavirina ha qualche effetto

30 Il mosaico del tabacco Il TMV appartiene al genere del tobamovirus che contiene piu’ di una dozzina di virus bastoncellari (dim nm) Il loro genoma consiste di un ssRNA (+) di circa 6.4 Kb. Il capside consiste di un solo tipo proteico configurato ad elica Il TMV in particolare pesa 39 Md, l’involucro proteico consiste di circa 2130 subunita’ proteiche e ogni subunita’ consiste di 158 AA. Il suo ssRNA consiste di 6.4 Kb ed ha 4 ORF tradotte in 4 proteine 1 delle quali e‘ la proteina di rivestimento (17.6 Kd), 2 (126 e 183 Kd) sono parti dell’RNA pol e la quarta fa parte del gruppo 30K di movimento I sintomi consistono in decolorazione a blocchi, clorosi, arricciamento, distorsione e nanismo delle foglie dei fiori e dell’intera pianta Infezione di giovani piante causa imbrunimento interno dei frutti. Le cellule infettate contengono particelle virali Il TMV e’ molto stabile puo’ svernare nelle foglie nel suolo e per molti anni nelle sigarette E’ trasmesso facilmente maneggiando prodotti del tabacco infetti Dal punto di ingresso (wound) il virus si muove da cellula a cellula attraverso I plasmodesmi e si moltiplica in ogni cellula Quando raggiunge il floema l’infezione diventa sistemica