Stadi nello studio biogenetico di una sostanza naturale Determinazione della fonte degli atomi di ossigeno ed eventualmente degli atomi di azoto. L’ossigeno.

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1 Stadi nello studio biogenetico di una sostanza naturale Determinazione della fonte degli atomi di ossigeno ed eventualmente degli atomi di azoto. L’ossigeno deriva tipicamente dall’acqua o dall’ossigeno atmosferico Definizione dei processi enzimatici coinvolti in ciascuno stadio di formazione della sostanza in esame. Questo aspetto può essere meglio studiato in vitro utilizzando enzimi isolati preparati in forma pura Definizione del cammino metabolico cioè della sequenza di intermedi e reazioni che portano alla formazione della sostanza in esame. Determinazione dell’origine degli atomi di carbonio che formano lo scheletro della sostanza in esame. Identificazione precursori metabolici (per es. acido acetico, acido mevalonico, acido scichimico)

2 PRINCIPALI APPROCCI USATI NELLO STUDIO DELLA BIOSINTESI 1.RIFLESSIONE E SPECULAZIONE SULLA STRUTTURA CHIMICA 2.ANALISI SEQUENZIALE 3.METODI CHE IMPIEGANO MUTANTI 4.USO DI INIBITORI SPECIFICI DI ALCUNI PROCESSI ENZIMATICI 5.METODI CHE IMPIEGANO TRACCIANTI ISOTOPICI A: isotopi radioattivi B: isotopi stabili

3 Possiamo distinguere tra:  Metodi che provocano forti alterazioni sul sistema in esame Inibizione enzimatica Uso di mutanti  Metodi di osservazione diretta con minima interferenza Analisi sequenziale Incorporazione di precursori marcati isotopicamente.

4 RIFLESSIONE E SPECULAZIONE SULLA STRUTTURA CHIMICA C126 x C2 AcetilCoA 1

5 Il successo di questa tecnica dipende da: LENTA CRESCITA DELL’ORGANISMO LENTO METABOLISMO METODO EFFICACE DI ANALISI QUANTITATIVA DEI METABOLITI 100 50 2 4 6 Settimane  g/frutto Variazione del contenuto di alcaloidi nei frutti della cicuta (Conium maculatum) Valutazione del contenuto di determinati metaboliti di un organismo in vari momenti del suo sviluppo.(es. se B si accumula nel tempo mentre A scompare, probabilmente A è precursore di B) ANALISI SEQUENZIALE 2

6 METODI CHE IMPIEGANO MUTANTI AUXOTROFI 1) è impiegato nello studio della biosintesi su microrganismi 2) il metodo consiste nel modificare il carattere genico dell’organismo da studiare per mezzo di mutageni (es. luce ultravioletta). Si isola quindi il microrganismo che manca di un enzima implicato in un certo processo biosintetico. 3) se la via biosintetica è: A B C D X Y e la cellula manca dell’enzima che trasforma C in D si avranno i seguenti effetti: A)La cellula auxotrofa non è in grado di crescere sul terreno di cultura su cui cresceva la cellula originaria (cellula vegetativa); B) Se si fornisce D o X al terreno di cultura la cellula continua a crescere e si avrà accumulo di C, se C è un intermedio obbligatorio nella biosintesi di X 3

7  Un mutante privo dell’enzima che regola la conversione X  Y presenta accumulo di X identificato come chinurenina.  Un altro mutante presenta accumulo di triptofano: per somministrazione di chinurenina si ha biosintesi di ommocromi. METODI CHE IMPIEGANO MUTANTI AUXOTROFI 3 Esempio: Biosintesi ommocromi in drosofila TRIPTOFANO  X  Y  OMMOCROMI

8 E’ possibile anche: Somministrazione contemporanea di un inibitore enzimatico e un precursore marcato. Esempio: dopo somministrazione a piante di tabacco di acido mevalonico marcato e un inibitore, si osserva accumulo di 2,3-epossisqualene radioattivo. In assenza di inibitore si isolano steroli marcati. Enzima-SH + I-CH 2 COO -  Enzima-S- CH 2 COO - + HI (Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) (enzima carbossimetilato; inattivo) 4 INIBIZIONE ENZIMATICA Consiste nell’uso di un inibitore di un enzima del processo biosintetico. Possono essere anche usati agenti chimici che bloccano selettivamente un enzima trasformandone selettivamente alcuni residui. Ac. Mevalonico  2,3-epossisqualene  Steroli

9 1.Viene immesso nel pool metabolico un metabolita marcato ovvero un composto in cui uno o più atomi sono stati sostituiti con i corrispondenti isotopi stabili o radioattivi. 2.Si assume che enzimi e membrane cellulari non riescano a distinguere tra molecole che differiscono soltanto per la sostituzione isotopica. 3.Seguendo la “traccia” è possibile isolare i prodotti di biotrasformazione del metabolita, se gli atomi marcati non sono stati perduti. 5 METODI CHE IMPIEGANO TRACCIANTI ISOTOPICI

10 Traccianti isotopici radioattivi più comunemente usati. 3 H  emittentet 1/2 12,35 annie max 0.0185 mev 29,2 Ci/mg atomo 14 C  emittentet ½ 5730 anniE max 0,156 Mev 62,4 mCi/mg atomo 32 P  emittentet ½ 14,45 giorniE max 1,7 Mev ( 1 Ci = 2,22 x 10 12 disintegrazioni per minuto (dpm) Metodo di rivelazione: scintillazione in fase liquida dpm= cpm /  = efficienza dello strumento per un particolare isotopo (0.5-0.9) (si determina mediante conta di campioni di riferimento) dpm= disintegration per minute cpm= counts per minute E’ possibile distinguere tra due radionuclidi (per es. 3 H e 14 C) contando la radioattività di ciascun nuclide su due diverse finestre di energia (canali) dello scintillatore. METODI CHE IMPIEGANO TRACCIANTI ISOTOPICI A: isotopi radioattivi

11 COMPOSTI MARCATI CON RADIOISOTOPI 1.Generalmente marcato (G): quando la distribuzione media del radioisotopo nelle varie posizioni della molecola è irregolare. Per es. D,L-[G- 3 H]fenilalanina i protoni su ciascuna posizione sono parzialmente sostituiti da atomi di trizio in maniera casuale. Questo tipo di marcatura è statistica e le molecole marcate differiscono nel numero e nelle posizioni dei radioisotopi. 2. Uniformemente marcato (U): quando la distribuzione media del radioisotopo è circa la stessa in tutte le possibili posizioni della molecola. Per es. se isoliamo come CO 2 gli atomi di carbonio delle varie posizioni della L-[U- 14 C]fenilalanina, la stessa abbondanza di 14 C verrà trovata in ciascun campione di CO 2 3.Specificamente marcato: quando i radioisotopi sono localizzati in alcune, ben definite posizioni con ben definite abbondanze relative (% dell’abbondanza totale specifica in 3 H o 14 C). La marcatura specifica può essere singola, doppia o multipla asseconda del numero di posizioni marcate. Per es. D,L-[1- 14 C]fenilalanina in cui tutta la radioattività del 14 C è concentrata sul gruppo carbossilico (C-1). Un composto marcato con un radioisotopo (in particolare 3 H e 14 C) può essere:

12 Alcune regole da seguire in un esperimento con precursori marcati con radioisotopi. 1.II precursore marcato deve essere somministrato alla più alta radioattività specifica e purezza chimica possibile e alla più bassa concentrazione possibile. 2.I prodotti isolati devono essere purificati rigorosamente preferibilmente per ricristallizzazione a radioattività specifica costante. 3.La posizione dell’atomo marcato ( o degli atomi marcati) nel prodotto deve essere localizzata a mezzo di degradazioni chimiche specifiche. Bisogna inoltre verificare l’assenza di “randomizzazione”.

13 BIOSINTESI GRISEOFULVINA

14 DOPPIA MARCATURA 1.Durante esperimenti di incorporazione quando si desidera seguire il destino di particolari atomi di idrogeno si ricorre spesso a precursori marcati sia 3 H che con 14 C. 2.Se si parte da un composto con un certo rapporto 3 H/ 14 C il valore di questo rapporto nei metaboliti finali dà informazioni sulla perdita o il trasferimento di atomi di idrogeno. Rimane valido il principio che la marcatura deve essere localizzata con metodiche degradative appropriate. 3.Generalmente il precursore da somministrare è una miscela di molecole marcate solo con 3 H e di molecole marcate solo con 14 C. 4.La marcatura intramolecolare ( 3 H e 14 C nella stessa molecola) è difficile da realizzare e può essere usata solo quale precauzione rispetto a possibili discriminazioni biologiche fra composti aventi la stessa struttura e soltanto differenze isotopiche (EFFETTO ISOTOPICO)

15  w = 3 H/ 14 C  x = 3 H/ 14 C w = precursore x= prodotto  w >  x Nessun 14 C  w ~  x ~~ DOPPIA MARCATURA

16 EFFETTO ISOTOPICO 1.PRIMARIO: VARIAZIONE DELLA VELOCITÀ DI REAZIONE DOVUTA ALLA ROTTURA O ALLA FORMAZIONE DI LEGAMI CON DIFFERENTI ISOTOPI, ES. ROTTURA DEL LEGAME C-T INVECE DEL LEGAME C-H 2.SECONDARIO: EFFETTI CINETICI DOVUTI ALLA SOSTITUZIONE ISOTOPICA SU ATOMI VICINI COINVOLTI IN UNA REAZIONE CHIMICA. È UN EFFETTO QUANTITATIVAMENTE MOLTO PIÙ PICCOLO DEL PRIMARIO 3.UN ENZIMA PUÒ MOSTRARE DIVERSA AFFINITÀ PER SUBSTRATI CON SOSTITUZIONE ISOTOPICA. EFFETTI ISOTOPICI CINETICI (SPECIALMENTE PRIMARI) VENGONO OSSERVATI QUANDO UN SUBSTRATO REAGISCE NEL SITO ATTIVO DELL’ENZIMA. Esempio:

17 1.Si effettuano esperimenti di incorporazione con precursori marcati con isotopi stabili ( 13 C, D, 15 N) e si analizza il destino della marcatura nei prodotti mediante NMR o spettrometria di massa. 2.A causa della scarsa sensibilità delle tecniche di rivelazione, si deve avere un arricchimento isotopico non inferiore all’1%. 3.Il vantaggio di questa tecnica consiste:  a)nell’assenza di pericoli dovuti alla radioattività.  b) nell’assenza di contaminazione da parte di prodotti estranei al pathway metabolico presenti anche in piccole quantità;  c) nella possibilità di localizzare la marcatura mediante analisi spettroscopica (NMR) o spettrale (massa) senza dover far uso metodi degradativi. METODI CHE IMPIEGANO ISOTOPI STABILI B. Isotopi stabili 5

18 METODI DI SOMMINISTRAZIONE DEI SUBSTRATI AD ORGANISMI VIVENTI 1.Somministrazione attraverso l’alimentazione: per animali, per es. insetti. 2.Iniezione: intravenosa, intraperitoneale, intramuscolare. 3.Perfusione: un organo è mantenuto in condizioni di normale attività metabolica con un opportuno liquido circolante. 4.Diffusione: Il substrato è disciolto o sospeso in mezzo acquoso in cui si trovano piccole parti di un organo o cellule. 5.Metodo dello stoppino d’ovatta: Inserito nel tronco o stelo di un vegetale. Basato sull’azione capillare dell’ovatta. 6.Metodo del taglio dello stelo: Lo stelo tagliuzzato alla base è immerso in soluzione acquosa contenente il precursore. 7.Metodo della spazzola: Una sospensione del precursore in olio di silicone è spazzolata sulle foglie delle piante.