OTTIMIZZAZIONE E VALIDAZIONE DI UN METODO DI CONFERMA PER LA DETERMINAZIONE DI NICARBAZINA NEI MANGIMI MEDIANTE HPLC CON RIVELAZIONE UV A SERIE DI DIODI.

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1 OTTIMIZZAZIONE E VALIDAZIONE DI UN METODO DI CONFERMA PER LA DETERMINAZIONE DI NICARBAZINA NEI MANGIMI MEDIANTE HPLC CON RIVELAZIONE UV A SERIE DI DIODI Marilena Muscarella, Ivana Decina, Marco Iammarino Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, via Manfredonia 20, 71121 Foggia, Italy e-mail:m.muscarella@izsfg.it La Nicarbazina (Fig.1) è un coccidiostatico non ionoforo costituito da quantità equimolecolari di 4,4'-dinitrocarbanilide (DNC) e 2-idrossi 4,6-dimetilpirimidina (HDP). È autorizzato come additivo per RISULTATI E DISCUSSIONE In figura 2 è riportato il cromatogramma di uno standard di nicarbazina 0.5 mg L -1 (A) ed un confronto tra un cromatogramma relativo ad un campione di mangime per polli negativo (B) ed uno additivato con nicarbazina ad una concentrazione di 0.5 mg kg -1 (C). È possibile apprezzare la buona simmetria del picco dell’analita, la netta separazione dello stesso da picchi di matrice interferenti oltre che la specificità del metodo. In fase di validazione è stata verificata la linearità strumentale elaborando i parametri della regressione lineare in termini di coefficiente di correlazione, pendenza e significatività dell’intercetta su tre rette di taratura e sulla media delle tre rette (R>0.999). Grazie a questa elaborazione sono stati determinati i limiti di determinazione (LOD = 3.7µg · kg -1 ) e di quantificazione (LOQ = 11.2 µg · kg -1 ) in matrice, così come descritto da Miller & Miller (2) ed il campo di misura (0.01 – 2.0 mg · kg -1 in matrice). La specificità del metodo è stata valutata verificando l’assenza di interferenti significativi in 20 campioni di mangime per polli, 6 campioni di mangime per equini, 6 campioni di mangime per altre specie animali non target e 6 campioni di materie prime per mangimi. L’accuratezza, in termini di recupero% e precisione (CV%), è stata verificata additivando a tre livelli (0.25, 0.50 e 0.75 mg kg-1) un campione di mangime per polli ed effettuando 6 prove ripetute per ogni livello, in 3 sedute analitiche, utilizzando la stessa apparecchiatura, ma differenti operatori (riproducibilità intra-laboratorio). Nelle tabelle 2 e 3 sono riassunti i dati ottenuti nelle 3 sedute di validazione. Questi dati soddisfano i requisiti di riferimento richiesti dalla Decisione 657/2002/CE sia in termini di recupero che di precisione. Gli studi di robustezza, secondo l’approccio di Youden (3), in termini di major changes, hanno dimostrato l’applicabilità del metodo a tutti i prodotti destinati all’alimentazione degli animali indicati nella Direttiva 2009/8/CE. La competenza del laboratorio nell’esecuzione dell’analisi di conferma è sicuramente garantita considerando i valori ottenuti per i limiti di decisione (LOD e LOQ) e per l’incertezza estesa relativa % (6.6%) e la possibilità di poter confrontare lo spettro di assorbimento della nicarbazina nel campione con quello di uno standard nel range di lunghezze d’onda 200-420 nm. INTRODUZIONE l’alimentazione dei polli da ingrasso fino ad una concentrazione massima di 50 mg kg -1 nei mangimi composti in combinazione con il narasin (1). La presenza di nicarbazina nei mangimi destinati a specie non bersaglio, dovuta a contaminazione crociata, pone problematiche non solo per la salute pubblica, ma anche per quella di specie animali non target. La recente normativa comunitaria (Direttiva CE N.8/2009 e Reg. CE N.124/2009) definisce i tenori massimi di nicarbazina per effetto di carry-over inevitabile in mangimi destinati a specie non bersaglio ed i livelli massimi di residui in alimenti di origine animale. La determinazione analitica di nicarbazina negli alimenti per uso zootecnico a livelli di contaminazione corrispondenti a quelli stabiliti dai regolamenti comunitari impone lo sviluppo di metodi con prestazioni analitiche idonee per il controllo ufficiale. In considerazione dei nuovi limiti legali è stato ottimizzato e validato un metodo analitico di conferma per la determinazione di nicarbazina nei mangimi basato sulla cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC) con rivelazione UV a serie di diodi. I requisiti del metodo analitico sono stati verificati tramite una procedura di validazione condotta integrando il Regolamento 882/2004/CE con i protocolli europei in materia di validazione riportati nella Decisione 657/2002/CE. Figura 1 – Formula di struttura della Nicarbazina ESTRAZIONE E CLEAN-UP - 5g di campione omogeneizzato + 15 mL di Acetonitrile in Falcon da 50 mL - Vortex-mix per 1 min e centrifugazione (3000 rpm–15’) - Filtrazione del surnatante su filtri Whatman 40 - Riduzione a secco in TurboVap -Solubilizzazione del residuo in 2ml di miscela Metanolo/Acetonitrile/Acqua (5/3/2) -Purificazione con 2 mL di n-esano -Filtrazione della fase acquosa con filtri Anotop LC (0.2 µm) -Iniezione di 20 µL nel sistema HPLC HPLC -Sistema HPLC Agilent Technologies SL 1200 Series -Colonna C18 LUNA (150 x 4.6 mm i.d., particle size 5 µm) (Phenomenex); T col = 30°C -Fase Mobile: Acqua/Acetonitrile 50/50 (v/v). Eluizione isocratica (flusso: 1.0 ml · min -1 ): -Rivelatore UV-DAD: λ= 350 nm (range di acquisizione: 200-420 nm) -Total run time: 20 minuti MATERIALI E METODI Livello di contaminazione (μg · kg -1 ) Concentrazione media determinata ± SD (n = 18) RSD R a (%) RSD R di riferimento b Recupero % 250185.7 ± 6.93.76.9674.3 500372.0 ± 13.93.76.2874.4 750584.1 ± 17.83.15.9077.9 a Deviazione standard relativa in condizioni di riproducibilità intralaboratorio b Calcolata mediante l’equazione di Horwitz (Dec. 657/2002/CE) Figura 2 – Confronto tra uno standard di nicarbazina 0.5 mg · L -1 (A), un campione di mangime per polli negativo (B) ed uno additivato con nicarbazina ad una concentrazio- ne di 0.5 mg · kg -1 (C) Tabella 1 – Parametri di riproducibilità intra-laboratorio per la determinazione di nicarbazina nei mangimi OperatoreLivello di contaminazione (μg · kg -1 ) Concentrazione media determinata ± SD (n = 6) RSD r a (%) RSD r di riferimento b Recupero % 1 250 192.0 ± 5.32.84.6476.8 2182.7 ± 5.93.24.6473.1 3182.2 ± 5.12.84.6472.9 1 500 373.8 ± 15.14.04.1874.8 2366.0 ± 12.03.34.1873.2 3376.3 ± 14.63.94.1875.3 1 750 582.0 ± 15.42.63.9377.6 2582.9 ± 19.13.33.9377.7 3587.5 ± 21.43.63.9378.3 a Deviazione standard relativa in condizioni di ripetibilità b Calcolata mediante l’equazione di Horwitz (Dec. 657/2002/CE) Tabella 2 – Parametri di ripetibilità per la determinazione di nicarbazina nei mangimi CONCLUSIONI Il metodo proposto offre numerosi vantaggi come semplicità, selettività ed efficienza. L’elevata sensibilità (LOQ) consente la determinazione di residui di nicarbazina anche in alimenti di origine animale ottenuti da specie animali diverse dai polli da ingrasso. La procedura di purificazione del campione e le condizioni cromatografiche ottimizzate permettono una buona separazione del picco dell’analita da interferenti di matrice rendendo il metodo specifico e selettivo anche grazie alla possibilità di valutare lo spettro di assorbimento nell’intervallo di lunghezze d’onda 200-420 nm. I risultati della validazione del metodo hanno dimostrato l’affidabilità del metodo analitico nell’analisi di conferma della nicarbazina nei mangimi ai limiti massimi di contaminazione crociata fissati dalla Commissione Europea con una minima preparazione del campione, assicurando una risposta analitica rapida, particolarmente utile negli schemi di monitoraggio e nelle analisi di controllo ufficiale. BIBLIOGRAFIA 1) Panel on contaminants in food chain, The EFSA Journal (2008) 690, 1-34. 2) E.J.C. Miller & J.N. Miller, Statistic for Analytical Chemistry (3rd Ed.) (1993) 155. 3) W.J. Youden, E.H. Steiner, Statistical Manual of the AOAC (1975) 35. 4) E. Hund, D.L. Massart, J. Smeyers-Verbeke, Trends Analytcal Chemistry (2001) 20(8), 394– 406.