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Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune Dott. Fortunato FerraraTutore e Relatore: Dott. Alberto Tommasini.

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Presentazione sul tema: "Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune Dott. Fortunato FerraraTutore e Relatore: Dott. Alberto Tommasini."— Transcript della presentazione:

1 Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune Dott. Fortunato FerraraTutore e Relatore: Dott. Alberto Tommasini

2 Lomeostasi del sistema immunitario Protezione dai microrganismi Tolleranza verso il SELF CD4+ CD25+ Cellule T regolatorie

3 Tolleranza periferica - Svolta principalmente dalle cellule T regolatorie. - Controllano e sopprimono la reattività contro il self di linfociti T sfuggiti alla selezione timica. Tolleranza centrale: Selezione positiva - Corteccia timica. - Timociti immaturi. - Riconoscimento della molecola MHC esposta dalle cellule dellepitelio timico. - Il non riconoscimento porta alla delezione. Selezione negativa - Zona interna (midollare) del timo. - È controllata da cellule presentanti lantigene (APC). - Timociti con alta affinità per gli antigeni self presentati dalle APC vengono eliminati.

4 Ruolo delle CD4 + Treg nelle situazioni di normalità o patologiche CD4 + CD25 + T reg Self Foreign Patogeni Tumori Trapianti Protezione dallo sviluppo di patologie autoimmuni Controllo dei processi immunitari T eff - Cellule T eff autoreattive sfuggite alla selezione timica Cellule T eff contro i non-self

5 Dalla clinica alla ricerca di base Il caso di Lorenzo… -Risposta solo parziale a nutrizione parenterale totale (non allergia!) -Nei mesi successivi si verificano diversi episodi di polmonite interstiziale, di eziologia incerta, accompagnati da peggioramenti dell'eczema e della diarrea, -Biopsia intestinale: enteropatia autoimmune. -Nel 2° anno anemia emolitica, alopecia e DMT1

6 Presente nei primi anni di vita: - IDDM - Severa enteropatia - Disordine epidermici - Fenomeni autoimmuni vari vari Autoanticorpi contro: TiroideRene Isole pancreatiche Intestino tenue Piastrine ed altro Disregolazione immunologica PoliendocrinopatiaEnteropatia Trasmissione X-linked recessiva IPEXIPEXIPEXIPEX Mancato funzionamento cellule Treg

7 FoxP3 nelle cellule Treg Foxp3 è un fattore trascrizionale – FKH family – specifico per le cellule T reg Foxp3 è un fattore trascrizionale – FKH family – specifico per le cellule T reg E il master regulator per lo sviluppo e la funzione delle cellule T reg E il master regulator per lo sviluppo e la funzione delle cellule T reg Le mutazioni del gene Foxp3 portano alla comparsa dellIPEX Le mutazioni del gene Foxp3 portano alla comparsa dellIPEX Come fattore trascrizionale: Regolatore/soppressore della produzione di citochine NFAT e NF-kappaB Blocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzione di citochine ed altri fattori essenziali allattivazione Ο = missense point mutations = deletion/frameshift mutations = splicing mutations

8 Induzione alla trascrizione di alcuni geni Soppressione della trascrizione di altri geni Il ruolo a valle di FOXP3

9

10 NFAT …a monte di FOXP3 Foxp3 ? Identificazione delle proteine che interagiscono con FOXP3, permettendo la localizzazione e funzione Patologie – IPEX like

11 Interessante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazione di FOXP3 Analisi degli interattori

12 Obbiettivi: 1- Produzione di Foxp3 come proteina ricombinante 2- Valutazione di diverse metodiche biomolecolari per isolamento di potenziali nuovi interattori

13 PBL cells mRNAcDNA PCRamplification N-term Zn-fing FKH FOXP3 + Mal Circa 90KDa 1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante Produzione Riconoscimento proteina con Ab-specifico Purificazione Foxp3

14 2.1 - Co-precipitazione Foxp3MBPAmilosioAmilosio MW 90 Kda 85 Kda 75 KDa 45 KDa Foxp3MBP MW 45 Kda 25 Kda 15 KDa

15 2.2 Immuno-precipitazione Foxp3 MBP Y Y Y Proteina G Foxp3 MBP Y Y Y

16 Phage display antibody libraries mRNA cDNA PCR assembly PCR Helper phageLymphocytes VH CH1 CH2 CH3 VL CL linker scFvcloning Amp Gene IIIscFv Phagemid vector Ori Transformation E. coli gene III scFv

17 VLVLVLVL VHVHVHVH VLVLVLVL VHVHVHVH VLVLVLVL VHVHVHVH ELISA WB Foxp3 CH3 CH2 SV5 Minibody

18 Immunoprecipitazione Foxp3 MBP Y Y Y Foxp3 MBP Y Y Y Verifica della metodica Per interattori noti (NFAT/NfkB)

19 Amp Gene IIIscFv Vettore pPAO fagmidico Ori cDNAframmentazione Cellule o tessuti 2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg

20 FP3 Isolamento cloni più reattivi sequenziamento Analisi sequenze: - 25 cloni selezionati - 24 riconfermano uno stesso peptide - 1 peptide diverso

21 ZnFKH PRR FOXP3 PRR Zn FKH Analisi dellinterazione con i domini -Il clone di tipo 1 è specifico per linterazione con il dominio Zinc-finger -Il clone di tipo 2 riconosce la proteina intera ma non uno dei singoli domini: eventuale effetto di mancata conformazione dei domini ricombinanti

22 BLAST: Sequences producing significant alignments: Score E value solute carrier family 25, member 23 [Homo sapiens] 176 4e-43 putative calcium binding transporter [Homo sapiens] 175 7e-43 La maggioranza dei cloni (24/25) codificano per una peptide di 100a.a. Q96NQ4_HUMAN_Q96NQ4 Efhand No description EF_HAND_2 EF_HAND_1 No description Calmodulin Calcineurin INTER PRO SCAN signaling proteins These proteins typically undergo a calcium - dependent conformational change which opens a target binding site.

23 BLAST: Sequences producing significant alignments: Score E value matrix metalloproteinase e-57 INTER PRO SCAN MATRIXIN Peptidase_M10 No description MATRIX METALLOPROTEINASE STROMELYSIN Il restante clone: They are zinc- dependent, calcium-activated proteases

24 interattore FP3 Y Y AP Clone selezionato (dominio EFH) prodotto in forma ricombinante

25 Analisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina B a – calcineurina B b – NFAT c – Foxp3

26 interattore FP3 Y Y AP Calc B FP3 Y Y AP EFH calcB FP3 Y Y AP

27 Cè la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel network di attivazione di FOXP3, ma solo motivi strutturali coinvolti. Risultati -Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3. -Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di ulteriori interattori molecolari di Foxp3. -Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini proteici interagenti con Foxp3. -Verificata linterazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH).

28 …sviluppi futuri e futuribili -Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina fisiologicamente significativa. -Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti tumorali o sedi di infiammazioni croniche). -Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.


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