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La regolazione secondo… Biochimica classica o MCA? Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys.

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Presentazione sul tema: "La regolazione secondo… Biochimica classica o MCA? Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys."— Transcript della presentazione:

1 La regolazione secondo… Biochimica classica o MCA? Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys. Chem. B, 114:16280–16289.

2 Regulation of Glycolysis What is the contribution of thermodynamics to the rate of a chemical reaction, whether catalyzed or uncatalyzed? Distinguishing between near- equilibrium and far-from-equilibrium reactions Come descriviamo la regolazione (della velocità) dei singoli enzimi e dei flussi? Basta sapere i ΔG/ΔG° ' ?

3 AB vfvf vrvr atto III (ovverosia la cinetica) v f = K f [A]v r = K r [B] Allequilibrio v f = v r e quindi K f [A] = K r [B] e cioè K f / K r = ([B] / [A]) = K eq Se non siamo allequilibrio, allora v f v r. Quanto differiscono? Quanto vale v r / v f ? Facciamo un passo avanti richiamando alcune nozioni di cinetica

4 Vale la disequilibrium ratio! AB vfvf vrvr vv Q o Γ Se questa reazione fuori dallequilibrio è immersa in una via (pathway) il cui flusso è v (velocità netta), allora: K eq

5 In una via allo ss, J = v = v f - v r o anche v f = v r + v, per cui: Se la reazione è vicina allequilibrio (ρ 1), allora: v << v f v r Se la reazione è lontana dallequilibrio (ρ 0), allora: v v f e v r 0 Generalizzando la reazione:

6 To assess the contributions of kinetics and thermodynamics to reaction rate one could plot v against a in linear rate and concentration space Il contributo dei due termini è difficile da interpretare perché i termini si moltiplicano

7 Ma usando ln(v) The rate is mainly determined by the forward rate (i.e., by kinetics) When >0.9, then v is mainly determined by the distance from equilibrium. The thermodynamic function dominates Net rate of the chemical reaction as a function of the concentration of A =0.9 =0.1

8 Questo tipo di ragionamenti hanno convinto i biochimici di 50 anni fa che le reazioni vicine allequilibrio sono catalizzate da enzimi presenti in eccesso e quindi questi enzimi non potranno essere limitanti per il flusso. Al contrario, in una reazione lontana dallequilibrio catalizzata da un enzima, la velocità della catalisi è poco più grande del flusso, per cui è potenzialmente limitante. Se una reazione è già vicina allequilibrio, e noi aggiungiamo enzima, la reazione si avvicinerà ancora un poco alleq., ma non ci sarà un grande aumento di P per cui non ci sarà propagazione del segnale, al contrario di reazioni lontane delleq. Quando la reazione è vicina allequilibrio (ρ 1), allora: v << v f v r

9 Alla ricerca del Rate Limiting Step (RLS) Tutti i ragionamenti sopra descritti hanno portato a postulare che in una via metabolica, quando un processo è dipendente, per quanto riguarda la sua velocità, da numerosi fattori separati, la velocità dellintero processo sarà determinata dal più lento dei fattori (Blackman, 1905)* (vedi anche Voet e Voet, p350) Cosa vuole dire in realtà dal più lento dei suoi fattori se in una via metabolica tutte le reazioni vanno alla stessa velocità (che corrisponde al flusso J della via)? Questo è verificato sperimentalmente nelle reazioni ed es. di decadimento, o anche in reazioni chimiche a molti stadi

10 Il RLS del flusso autostradale (ma descrive il metabolismo?) Fuorviante per due motivi: v dipende da S e da P (e può anche tornare indietro!)

11 Il Rate Limiting Step significa: Che la velocità di una via possa essere variata solamente cambiando lattività di un particolare enzima.

12 5. Regulatory Enzyme In metabolic pathway, there is at least one enzyme that set the rate of overall sequence ……… Regulatory Enzyme Example : Glycolysis pathway Hexokinase, Pyruvate kinase ect. There are two major classes of regulatory enzymes in metabolic pathway. (1) Allosteric enzyme : function through reversible, noncovalent binding of regulatory compounds allosteric modulator Allosteric modulator small metabolites, cofactor….. activator (positive), inhibitor (negative) (2) Other enzyme : reversible covalent modification Da Lehninger

13 …ma come identificarlo? Un enzima potenzialmente regolatore è stato definito come: * quello che catalizza una reazione lontana dallequilibrio * la cui attività è controllata da fattori diversi dai substrati * lenzima che risponde al primo segnale metabolico e che provoca i successivi cambiamenti nellattività dei restanti enzimi Per questo lo studio del controllo del metabolismo coincideva essenzialmente con lidentificare i RLS. Si è cercato prima di identificare gli enzimi potenzialmente regolatori e poi, tra questi, quello che fosse il RLS.

14 Pho Pgl Trn Hek Gpi Pfk Pgm Eno Pyk Displacement of reaction in perfused Rat heart ρ Nella glicolisi quali sono gli enzimi più lontani dallequilibrio?

15 Nella glicolisi nel cuore di ratto presenta almeno quattro reazioni con un ρ più piccolo di 0.1 (valore indicativo) per cui non si può decidere quale sia il RLS Proviamo a cercare un altro indicatore valido per identificare il RLS. Storicamente ne sono stati proposti diversi, come ad esempio il valore del rapporto tra massima attività catalitica e flusso nella via (V M / J); quanto più il rapporto è tendente a 1 tanto più lenzima sarà limitante

16 Relative enzyme activities in perfused Rat heart 10 3 Pho Pgl Hek Gpi Pfk Ald Tim Gad Pgk Pgm Eno Pyk Lad Nella glicolisi quali sono gli enzimi con maggiore V M ? Nella glicolisi la V max di molti enzimi sembra in largo eccesso rispetto al flusso

17 Anche qui non possiamo definire con certezza quale sia il RLS Questi metodi non arrivano a conclusioni univoche, per cui si ricorreva spesso a conferme con criteri diversi (cross-over, misure di flussi con isotopi, presenza di regolatori allosterici, mutanti metabolici, aggiunta di intermedi…) La presenza di un RLS (anche detto Rate Determining Step) cosa comporta? 1)il flusso a questo step vari in risposta alla richiesta metabolica 2)la variazione di flusso sia trasmessa lungo la via Vedi trattazione sulla propagazione della variazione (V&V, p.470)

18 In una via allo ss, J = v f - v r Se esistesse un RLS, questo comporterebbe: 1)che lenzima sia il primo a cambiare attività (flusso) 2)e che la variazione di flusso sia trasmessa lungo la via attraverso un aumento del prodotto Se il prodotto A passa da [A] ad ([A] + Δ[A]), il flusso varia ΔJ = Δv f Come esprimiamo v f ? Come si propaga la variazione di flusso a partire da un RLS? (secondo Voet & Voet)

19 Se [A]<< K M allora: that is, the fractional change in reaction rate is equal to the fractional change in sustrate conv. Se [A]<< K M allora:

20 Inoltre lassunzione per cui [A]<< K M rischia di essere irreale Cè contraddizione tra le due espressioni: come posso descrivere una reazione reversibile con una MM irreversibile??? … spesso le [S i ] sono ~K M (se non maggiori) < <

21 THIS IS ALL CRAP! Gli enzimi sono reversibili Non si può fare di necessità virtù nel caso degli enzimi*. Abbiamo bisogno di un modo di ragionare diverso e soprattutto quantitativo. Tutti gli enzimi (vicini o lontani dallequilibrio) influenzano il flusso (con meccanismi diversi) Le vie metaboliche hanno variazioni incredibili di flusso con piccole variazioni di concentrazione degli intermedi: nella glicolisi si verifica un aumento di flusso di volte ma la concentrazione degli intermedi aumenta di circa 10 volte.

22 The law of the flush (1) (legge dello sciacquone) A B ΔhΔh hAhA hBhB Flux (l/s) = πr 4 Δp/8ηΔx Δp=kΔh In metabolic terms ΔG is the driving force and V max the flux carrying capacity (amount of enzyme). When ΔG is large V max can be small. F6P + ATP F1,6BP + ADP ΔG= -22 KJ/mol Reazioni lontane dalleq. r: raggio del tubo Δp: differenza di pressione η: viscosità del liquido Δx: lunghezza del tubo (Δp/Δx)= driving force πr 4 8η = Flux carrying capacity

23 The law of the flush (2) G6P F6P ΔG= -1.4 KJ/mol Reazioni vicine alleq. When the driving force ΔG is small, V max (amount of enzyme) must be high Flux (l/s) = πr 4 Δp/8ηΔx

24 v S P=0 P=1 P=3 P=5 V max =5 K S = 0.5 K eq = 1 K P = 1 S =5.05 Velocità di un enzima MM reversibile in presenza di quantità crescenti di Prodotto Mantenendo S costante e vicino al valore di equilibrio, la velocità, in presenza di quantità crescenti di P, crolla P = 0, v = 4.56 P = 1, v = 3.35 P = 3, v = 1.45 P = 5, v = Che relazione tra v e V max ? Reazioni con ΔG ~0

25 S =5.05 v P = 0, v = 4.56 P = 1, v = 3.35 P = 3, v = 1.45 P = 5, v = S =5.05 P=3 P=5 ( V P=0 /V P=5 ) = 150 V max /V in vivo an enzyme close to equilibrium has to be in large excess to keep the reaction close to equilibium

26 P=0 P=1 P=3 P=5 V max =5 K S = 0.5 K eq = 1000 K P = 1 S =5.05, P = 0, V = 4.55 S =5.05, P = 1, V = 4.17 S =5.05, P = 3, V = 3.57 S =5.05, P = 5, V = 3.13 S =5.05 Un enzima con K eq molto grande sente molto meno questo problema (a meno che P non sia più grande di S di vari ordini di grandezza ) È una reazione con ΔG° <<0

27 A systemic view Combinando reazioni vicine o lontane rispetto allequilibrio Per le reazioni che sono lontane dallequilibrio occorre avere dei limitatori del flusso, altrimenti il serbatoio a monte si svuota e quello a valle si riempie Per le reazioni vicine allequilibrio, il flusso si si riduce quanto più ci si avvicina allequilibrio. Un flusso dignitoso richiede un tubo grosso, perchè la driving force è piccola.

28 La relazione tra ΔG e ΔG°' Athel Cornish-Bowden (1997) Harden and Youngs Discovery of Fructose 1,6-Bisphosphate, pp in New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (ed. A. Cornish-Bowden), Universitat de València, Valencia, Spain.New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge articolo disponibile a: Su questi aspetti: Morandini (2009) Plant Science 176: Non sempre le reazioni con un ΔG°' grande presentano poi anche un ΔG grande. Qui si spiega il perché…

29 Table 1. Thermodynamic characteristics of the early reactions of fermentation

30 What happens at a physiologically realistic concentration (around 50 μM) for both [G3P] and [DHAP]? the concentration of fructose 1,6-bisphosphate at equilibrium will be 37 μM The use of ΔG 0 referred to above to predict which direction of reaction is favoured is worse than naive; it is wrong! putting all three concentrations to 50 μM, we get: una reazione può procedere in vivo in direzione opposta a quanto indicato dal ΔG 0. Ciò che conta è ΔG !

31 Due corollari importanti Le reazioni con un ΔG°'<<0 sono spesso obbligate in vivo ad avere un ΔG<<0 * Le reazioni che con un ΔG°'~0 sono spesso obbligate ad avere in vivo un ΔG~0 * Quello che conta comunque è il ΔG (ρ) Le reazioni con ΔG<<0 devono essere regolate Le reazioni con ΔG ~0 si regolano da sole * Rischia di essere una semplificazione grossolana se non si considerano fattori come il n. di reagenti e substrati, la loro conc., il coinvolgimento di specie chimiche a conc. costante come H 2 O...) Gli enzimi non possono fare di necessità [regolazione] virtù [capacità di controllo]

32 From a physiological point of view the most surprising result was that the heavily regulated allosteric enzyme, glycogen synthase, does not control flux but is needed to maintain homeostasis during flux changes. This novel role for a phosphorylated allosteric enzyme is proposed to be a general phenomenon in metabolic and signaling pathways, which physiologically link different cellular activities. Shulman and Rothman (2001) 13 C NMR of intermediary metabolism: implications for systemic physiology. Annual Review of Physiology. 63:15-48.

33 Effetto dellenzima: Rate constant Mass action term Saturation term Come lenzima regola? enzymes bring two additional properties into the mix, i.e., binding and catalysis

34 ...usando il passaggio a ln(v) Fig. from Rohwer & Hofmeyr (2010)

35

36 The uni-uni reaction equation can be recast in a slightly different form: where (v cap )= k 2 E t /K s This term was inglobated with V f in the previous formulation, but was moved here Decomposition according to Rohwer & Hofmeyr (Stellenbosch) Decomposition according to P. Morandini (UniMi) where (V f )= k 2 E t

37 v s ln v VfVf v v ma Σ v cap (no enzyme) v approaches V f at increasing s La decomposizione evidenzia meglio il limite di V f

38 Allaumentare della driving force lultimo termine diventa S, che, combinato con il secondo termine diventa uguale a 1. rimane solo V f Se 0 S Se 0 0 significa che P >K s

39 Decomposition according to R. Milo (Weizmann ist.) Se 0 0 significa che P >K s Se 1

40 VfVf v v the Bin v ln v v cap (no enzyme) s Anche questa decomposizione evidenzia il limite di V f

41 Referenze Per la parte di cinetica chimica vedere: * Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap e Per il concetto di RLS, vedi * Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap. 4 Per la relazione tra ΔG° e ΔG° per le reazioni biochimiche, vedere: Athel Cornish-Bowden (1997) Harden and Youngs Discovery of Fructose 1,6-Bisphosphate, pp in New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (ed. A. Cornish-Bowden), Universitat de València, Valencia, Spain.New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge Articolo disponibile a:


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