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Biotecnologie vegetali per lindustria e lambiente Biochimica classica - atto I Il Cavallo Rosso E. Corti (Ed. ARES)

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Presentazione sul tema: "Biotecnologie vegetali per lindustria e lambiente Biochimica classica - atto I Il Cavallo Rosso E. Corti (Ed. ARES)"— Transcript della presentazione:

1 Biotecnologie vegetali per lindustria e lambiente Biochimica classica - atto I Il Cavallo Rosso E. Corti (Ed. ARES)

2 Come manipolare il metabolismo? È necessaria la comprensione del sistema metabolico e di come venga modulato il flusso Metà corso dedicato alla comprensione dei sistemi multienzimatici Metà corso a discutere degli interventi di ingegneria metabolica

3 Il metabolismo: questo sconosciuto Un centinaio di anni di studio degli enzimi e dei metaboliti ci ha permesso di costruire accurate mappe metaboliche: E. Buchner: cell-free fermentation "Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells""Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells". (1897) Ber. Dt. Chem. Ges. 30: 117–124.

4 Teoria generale capace di predire i flussi? vie metaboliche enzimologia Flux is phenotype! (H. Kacser) E possibile descrivere il metabolismo a partire dalle proprietà (studiate di solito in vitro) dei suoi componenti?

5 Cinetica di MM irreversibile E + S = ES E + P Derivazione della formula reperibile su tutti i testi (decenti) di biochimica. Formula e curva sono la stessa cosa detta in due modi diversi!!! Breve ripasso di enzimologia Colmate le lacune con attenzione (ad es. Voet & Voet, Biochemistry)

6 Curva v/S Significato di K M e V m ; unità di misura

7 Molte rappresentazioni della cinetica sono sballate Quando v raggiunge Vmax? A [S] infinito, cioè mai!

8 Linearizzazione y = 0x = 0 Esistono tipi diversi di linearizzazione (vedi Voet e Voet o Fell)

9 Inibizione competitiva Il valore di K m viene aumentato: K M app = K M (1+I/K i )= K M α Linibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato E + S = ES E + P EI + S = EIS no reaction + I es. Succinato deidrogenasi: fumarato (S) e malonato (I) Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore? KiKi

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11 Inibizione incompetitiva Il valore di V m viene diminuito: V m app = V m /(1+I/K i )= V m / α Linibizione, inefficace a basse [S], non si annulla ad alte [S] E + S = ES E + P EIS no reaction + I Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore? es. EPSP sintasi (con glifosate) KiKi

12 Reazione della EPSP sintasi e sua inibizione da parte del glifosate OH OH COO - -2 O 3 PO CH 2 OH O COO O 3 PO - OOCNHPO 3 2- Shikimato-3-fosfato Fosfoenolpiruvato (PEP) Glifosate 3-enolpiruvil-3-shikimato -fostato (EPSP) EPSP sintasi CH 2 O -2 O 3 PCOO - Nonostante assomigli molto a parte dello shikimato, il glifosate è un inibitore competitivo del PEP. La reazione è sequenziale, con lo shikimato che entra per primo, per cui il glifosate risulta essere un inibitore incompetitivo di questo primo substrato. Questo causa laccumulo di Shikimato e la riduzione in Arogenato (che è un inibitore della DHAP sintasi che quindi esacerba laccumulo di Shikimato) (vedi note)

13 Inibizione mista Sia V m che K m cambiano: V m app = V m / α e K M = α K M /α Linibizione si sente sia a bassa che ad alta concentrazione di S E + S = ES E + P Che faccia avrà la linearizzazione in presenza di inibitore? EIS no reaction EI + I + I KiKi KiKi

14 Le inibizioni dal punto di vista grafico

15 Equazione MM reversibile Per una dimostrazione elegante:

16 Due conseguenze importanti: La v della reazione reversibile sarà minore di quella irreversibile per due motivi: La presenza di prodotto rende più piccolo il numeratore La presenza di prodotto rende più grande il denominatore

17 La relazione di Haldane Allequilibrio v = 0 per cui il numeratore sarà = 0 = K eq

18 Le costanti cinetiche non sono indipendenti! Una formulazione alternativa dellequazione si ottiene sfruttando la relazione di Haldane (sostituisco V r ) Ricordatevi che il valore della K eq è indipendente dalla presenza dellenzima

19 Quando la K eq >>1 Leffetto di P si fa sentire solo sul denominatore (si parla di inibizione da prodotto) (cioè una reazione molto spostata verso i prodotti) )

20 Che altro non è se non lequazione per la reazione irreveversibile Inoltre se [P]/K P è bassa ( 0 o comunque <<1)

21 Importantissimo Lequazione di MM irreversibile non descrive il comportamento in vivo perché la maggior parte degli enzimi catalizzano reazioni reversibili. Quella reversibile è cruciale per descrivere i sistemi reali Inoltre la maggior parte delle reazioni enzimatiche hanno più di un substrato o di un prodotto per cui si richiedono equazioni più complesse.

22 Enzimi a più substrati/prodotti A + B C + D Classificati secondo il meccanismo: *Random order * Compulsory order * Ping Pong Sequenziali Equaz. generale (irrev.)

23 Enzimi allosterici: Molti enzimi non hanno curve iperboliche, ma sigmoidi, per cui sono stati introdotte teorie per spiegare questi comportamente (Hill, MWC e Koshland) v =V m *(x*(1+x) n-1 +L*c*x*(1+c*x) n-1 )/((1+x) n + L*(1+c*x) n ) [MWC model] Andate a rivederli sul testo di biochimica !

24 atto II (ovverosia la termodinamica) Dopo le nozioni essenziali di enzimologia, ripassiamo alcuni concetti di termodinamica che sono rilevanti per le vie metaboliche

25 Si raggiunge sempre uno stato stazionario (ss)? La presenza di un flusso in una via metabolica cosa implica dal punto di vista termodinamico? Un G 0 (<0) G = G°' + RT lnQ Q = quoziente di reaz. Alleq. G= 0 e G°' = –RT lnK eq Che conseguenze avrebbe non raggiungere uno ss… G°' = –RT lnK eq = –2.3RT Log 10 (Keq) G°' è la variazione di energia libera in condizioni standard

26 Da Lehninger Ordine di grandezza ATP + H 2 O ADP + Pi G o ' = -31 kJoules/mol Pi + glucose glucose-6-P + H 2 O G o ' = +14 kJoules/mol

27 Values of G o and K eq for common reactions at 25 o C SO 3 (g) 2 SO 2 (g) + O 2 (g) x H 2 O(l) H + (aq) + OH - (aq) x AgCl(s) + H 2 O Ag + (aq) + Cl - (aq) x HOAc(aq) + H 2 O H + (aq) + OAc - (aq) x N 2 (g) + 3 H 2 (g) 2 NH 3 (g) x 10 5 HCl(aq) + H 2 O H + (aq) + Cl - (aq) x 10 6 Cu 2+ (aq) + 4 NH 3 (aq) Cu(NH 3 ) 4 2+ (aq) x Zn(s) + Cu 2+ (aq) Zn 2+ (aq) + Cu(s) x Reaction G o (KJ/mol) K eq R = [15] J · K-1 · mol-1 G o (kJ/mol)

28 Quoziente di reazione e Keq

29 G = G°' + RT lnQ = –RT lnK eq + RT lnQ = = RT ln(Q/K eq ) = RT ln ρ (con ρ Disequilibrium ratio) Che valori assume ρ ? Ovviamente tra 0 e 1 per G <0 Quanto più ρ è vicino a 0 tanto più G < 0 (reaz. spontanea) ρ (o G, che concettualmente è la stessa cosa) è considerato da molti un indice potenziale di regolazione: *se ρ è molto piccolo ( 0) si ritiene che lenzima sia un potenziale sito di regolazione (se ρ 1 cè poca possibilità di regolazione) ρ

30 Il loro rapporto vale (=Q), da cui posso calcolarmi G

31 ΔG°' e ΔG in vivo nella glicolisi

32

33 Perché ρ è considerato un indice di potenziale regolazione? I metaboliti devono essere a concentrazioni nel range μM- mM A) Non possono essere a concentrazioni molto alte (es. 1M) * perché ci sarebbero effetti osmotici pesanti * perché le variazioni nel metabolismo sarebbero lente (ci sarebbe molto intermedio da smaltire) * perché si investirebbe molto in intermedi (e non prodotti)

34 B) Non possono essere a concentrazioni molto basse (es. nM) * perché gli enzimi avrebbero K m basse e quindi una bassa efficacia catalitica: K cat / K m vale al max * perché gli intermedi verrebbero esauriti velocemente (non ci sarebbero riserve efficaci di metaboliti) K cat = V max /E tot = turnover number n. di reazioni catalizzate da ogni sito attivo ogni secondo; per un enzima MM vale K 2. Non può essere maggiore della frequenza con cui substrato ed enzima si incontrano. Se ogni incontro è produttivo, si avrà la perfezione catalitica k cat is called the turnover number k cat = moli di substrate trasformato / mole di enzima/secondo

35 Quando [S] << K M (soluzioni diluite) ricaviamo ammettendo E= E tot : = (k 2 /K M )[E][S] ~ (k cat /K M )[E][S] Pendenza della retta Rate constant per reaz. Bimolecolare Non può essere maggiore della velocità dincontro

36 (k cat /K M ) vale al massimo cioè il valore massimo compatibile con la diffusione Diffusion theory predicts that kcat/K M will attain a value of about (mol/L) -1 s -1. Carbonic anhydrase, Catalase, Fumarase and Triose phosphate isomerase actually approach this limit. TIM accelerates isomerization by a factor of compared with the rate obtained with a simple base catalyst such as acetate ion. Indeed, the k cat /K M ratio for isomerization of glyceraldehyde 3-phosphate is 2 × 10 8 M -1 s -1.

37 Da Lehninger The k cat and activation energy of Rubisco from a variety of C 3 and C 4 plants Sage et al.

38 Se questi 2 ragionamenti sono veri, ne consegue che : * quando G° ' <<0 la reazione deve rimanere lontana delleq. * quando G° ' 0 (K eq 1) la reazione deve rimanere vicina alleq. Cosa significa (approssimativamente)? G <<0 G 0 Cosa succederebbe infatti se le reazioni con G° ' <<0 andassero allequilibrio?

39 E cosa succederebbe se le reazioni con G° ' 0 fossero lontane dallequilibrio… [P] >> [S] Con due reazioni di questo tipo in fila (come ad es. nella glicolisi G G6P F6P F1,6BP*), allora: [S] << [P 1 ] [P 2 ] << [P 3 ] e più precisamente: ([F1,6BP][ADP] 2 / [G][ATP] 2 ) = 10 6 [P] << [S]

40 Riassumendo: Le concentrazioni dei metaboliti possono rimanere dentro ambiti sensati (μM-mM) se le reazioni con * G° ' <<0 rimangono lontane dallequilibrio ( G <<0, vale a dire ρ 0). Tali reazioni quindi devono essere ben regolate! * G° ' 0 rimangono vicine allequilibrio ( G 0) Queste reazioni devono essere catalizzate da enzimi in eccesso (altrimenti rallentando rimarrebbero lontane dallequilibrio)

41 Da Lehninger TPI aumenta la velocità della reazione 10 9 volte!!

42 Referenze Per la cinetica enzimatica vedere * Testo di biochimica (ad es. Voet and Voet, Biochemistry) * Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap. 3 Per la parte di cinetica chimica vedere: * Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap e 1.4.3

43 Effect of reversible inhibitors on the reaction rate: no inhib. a) mixed inhib. ([I] = K i = 0.5 K i '); lower V max app (= 0.67 V max ), higher K m app (= 2 K m ). b) competitive inhib. ([I] = K i ); V max app unchanged (= V max ), higher K m app (= 2 K m ). c) uncompetitive inhib. ([I] = K i '); lower V max app (= 0.5 V max ) and K m app (= 0.5 K m ). d) noncompetitive inhib. ([I] = K i = K i '); lower V max app (= 0.5 V max ), unchanged K m app (= K m ).

44 A special case of uncompetitive inhibition is substrate inhibition which occurs at high substrate concentrations in about 20% of all known enzymes (e.g. invertase is inhibited by sucrose). It is primarily caused by more than one substrate molecule binding to an active site meant for just one, often by different parts of the substrate molecules binding to different subsites within the substrate binding site. If the resultant complex is inactive this type of inhibition causes a reduction in the rate of reaction, at high substrate concentrations. It may be modelled by the following scheme:

45 Effect of substrate inhibition the reaction rate. A comparison is made between the inhibition caused by increasing K S relative to K m. no inhibition, K S /K m >> 100; K S /K m = 100; K S /K m = 10; K S /K m = 1. By the nature of the binding causing this inhibition, it is unlikely that K S /K m < 1.

46 Competitiva

47 Incompetitiva

48 Mista Quando α = α si parla di in. non-competitiva (la Km non cambia)

49 Effetto degli inibitori sui parametri cinetici


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