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Università di Bologna Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale Sezione di Microbiologia Tecniche di amplificazione real-time nella.

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1 Università di Bologna Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale Sezione di Microbiologia Tecniche di amplificazione real-time nella determinazione della carica virale Parvovirus B19 e Papillomavirus umani Giorgio Gallinella

2 La ricerca di acidi nucleici virali mediante PCR assicura:  Specificità – la scelta nell’utilizzo dei primer determina il bersaglio della reazione  Sensibilità – la definizione delle condizioni di reazione determina il livello di sensibilità della reazione La determinazione quantitativa mediante real-time PCR permette:  Valutazione quantitativa come parametro diagnostico  Valutazione quantitativa in corso di screening  Valutazione quantitativa in corso di follow-up Diagnosi virologica e determinazione del carico virale Real-Time PCR nella diagnosi virologica

3 La determinazione mediante PCR end-point fornisce informazioni qualitative:  Informazioni quantitative possono essere ottenute mediante modificazioni della tecnica di base (diluizioni end-point, PCR competitiva, …) La determinazione mediante PCR real-time fornisce informazioni quantitative:  Informazioni quantitative possono essere ottenute direttamente mediante analisi in tempo reale delle curve di accumulo dei prodotti di reazione Diagnosi virologica e determinazione del carico virale Real-Time PCR nella diagnosi virologica

4 La tecnica di PCR real-time:  Si basa sulla rivelazione dell’emissione luminosa di fluorocromi presenti nella miscela di reazione  Fluorocromi intercalanti (SybrGreen)  Flurocromi legati a sonde (FRET, Taqman, Molecular Beacons)  Utilizza strumenti che sono in grado di rilevare in tempo reale l’emissione luminosa dei fluorocromi  Thermal Cyclers a blocco  Thermal Cyclers ad aria  Utilizza software in grado di effettuare analisi quantitative e delle curve di melting dei prodotti di amplificazione Diagnosi virologica e determinazione del carico virale Real-Time PCR nella diagnosi virologica

5 Diagnosi virologica e determinazione del carico virale Real-Time PCR nella diagnosi virologica Determinazione quantitativa mediante PCR real-time nello studio delle infezioni da Parvovirus B19 e Papillomavirus umani

6 Famiglia Parvoviridae Genere Erythrovirus DNA monocatenario  5600 nucleotidi Struttura icosaedrica Privo di pericapside Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Caratteristiche molecolari di Parvovirus B19

7 Infezione da Parvovirus B19 Schema patogenetico dell’infezione da Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

8 Principali manifestazioni cliniche dell’infezione da Parvovirus B19  Eritema infettivo  Artralgie/Artropatie  Crisi aplastica transitoria  Idrope fetale e infezioni congenite  Possibile sviluppo di infezioni persistenti  Valutazione del carico virale per una più corretta valutazione del processo infettivo  Necessità di valutare l’andamento temporale del carico virale nel corso di infezioni croniche o persistenti Infezione da Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

9 Vie di trasmissione dell’infezione da Parvovirus B19  Trasmissione aerogena  Trasmissione materno-fetale  Trasmissione mediante sangue ed emoderivati  Necessità di valutare il carico virale nelle unità di donazione e nei pool di plasma per la produzione di emoderivati  Valore soglia ammesso di contaminazione da parvovirus B19 nei pool di plasma per la produzione di emoderivati pari a 10 4 UI/ml Infezione da Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

10 Infezione in soggetti normali Picco viremico e graduale clearance virale Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG Depressione transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo modesto dell’emoglobina Manifestazioni cliniche bifasiche: 1. Sintomi aspecifici 2. Rash, artralgia (quinta malattia) Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19

11 Infezione in soggetti con stress eritroide Picco viremico e graduale clearance virale Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG Depressione acuta ma transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (TAC) Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19

12 Infezione in soggetti con deficit del sistema immunitario Picco viremico e ritardata o assente clearance virale Deficit (quantitativo e/o qualitativo) di anticorpi specifici di classe IgM e IgG Depressione persistente della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (PRCA) Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19

13 Materiale biologico Sangue periferico, plasma, siero Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR Determinazione anticorpi specifici anti-B19 (IgG+IgM) Rilevanza diagnostica Infezioni acute:malattia esantematica, artropatia crisi aplastica midollare Infezioni croniche:artropatia, aplasia eritrocitaria Infezioni in gravidanza:infezione materna Diagnosi di infezione da Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

14 Materiale biologico Sangue midollare, sangue fetale, liquido amniotico, biopsie tissutali Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR Ricerca virus mediante ibridazione in situ Rilevanza diagnostica Infezioni acute:crisi aplastica midollare Infezioni croniche:aplasia eritrocitaria Infezioni persistenti:presenza del virus nei tessuti Infezioni in gravidanza:infezione fetale Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19

15 Presenza di marcatoriNumero di campioniPercentuale DNA neg/ IgM neg/ IgG neg DNA pos/ IgM neg/ IgG neg144.1 DNA pos/ IgM pos/ IgG neg92.6 DNA pos/ IgM pos/ IgG pos DNA pos/ IgM neg/ IgG pos DNA neg/ IgM pos/ IgG pos267.6 DNA neg/ IgM neg/ IgG pos Campioni con marcatore unico Totale campioni Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19

16 Presenza di marcatoriNumero di campioniPercentuale DNA neg/ IgM neg/ IgG neg DNA pos/ IgM neg/ IgG neg144.1 DNA pos/ IgM pos/ IgG neg92.6 DNA pos/ IgM pos/ IgG pos DNA pos/ IgM neg/ IgG pos DNA neg/ IgM pos/ IgG pos267.6 DNA neg/ IgM neg/ IgG pos Campioni unicamente DNA pos Totale campioni Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19

17 Ricerca di Parvovirus B19 La ricerca del DNA di Parvovirus B19 mediante PCR deve:  Permettere una valutazione quantitativa del carico virale  Includere l’utilizzo di un reagente di controllo analitico Modalità di quantificazione mediante real-time PCR:  Quantificazione relativa (riferimento a campione calibratore)  Quantificazione assoluta (riferimento a curva standard)  Utilizzo di un controllo analitico interno  Eterologo  Omologo Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

18 Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR Sono state descritte numerose coppie di primers che consentono un’efficiente amplificazione del bersaglio virale (del genoma virale oppure dellle diverse classi di messaggeri) Ricerca di Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

19 Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR: PCR Real-Time  Rivelazione della fluorescenza emessa da un fluorocromo intercalante (SybrGreen)  Rivelazione della fluorescenza emessa da fluorocromi legati a sonde oligonucleotidiche (FRET, Taqman, Beacons, …)  Monitoraggio in tempo reale, ciclo per ciclo, della quantità di prodotto di amplificazione Ricerca di Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

20 Ricerca di Parvovirus B19 Sviluppo di una tecnica di PCR real-time calibrata:  Amplificazione in due reazioni parallele del bersaglio virale e di un bersaglio di riferimento eterologo  Rivelazione dei prodotti di PCR mediante SybrGreen e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point  Quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto mediante applicazione della formula:  E target ed E reference sono le efficienze, determinate sperimentalmente, delle due diverse reazioni di amplificazione   Cp (calb-sample) sono le differenze fra i crossing point del campione calibratore e dei campioni in esame Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

21 Ricerca di Parvovirus B19 Virus Ref Amplificazione parallela del bersaglio virale e del bersaglio di riferimento Virus Valutazione dell’efficienza della reazione: E Virus = Valutazione della variabilità della reazione:  Cp Virus = % Riferimento Valutazione dell’efficienza della reazione: E Ref = Valutazione della variabilità della reazione:  Cp Ref = % Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

22 Ricerca di Parvovirus B19 Analisi di regressione Slope  SD of Slope  Standard Error  R  Curve di regressione ottenute per la quantità calcolata di bersaglio virale rispetto alla quantità attesa, utilizzando come campione calibratore ciascun campione nell’intervallo geq Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

23 Ricerca di Parvovirus B19 Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG- N=3, Media: 1.1e9; Mediana: 1.4e9 CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG+ N=24, Media: 4.3e6; Mediana: 8.7e4 CAMPIONI PCR+, IgM-, IgG+ N=11, Media: 3.7e5; Mediana: 3.2e4 Determinazione quantitativa del carico virale in campioni di siero

24 Ricerca di Parvovirus B19 Analisi mediante real-time PCR calibrata su campioni di siero ottenuti da pazienti con documentata infezione persistente da Parvovirus B19, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 10 4 geq/ml Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata: Nei pazienti seguiti il carico virale è risultato compreso fra 10 2 – 10 6 geq/ml per periodi estesi di tempo Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

25 Ricerca di Parvovirus B19 Analisi mediante real-time PCR calibrata su 16 pool di plasma destinati alla produzione di emoderivati, costituiti ciascuno da 960 singole donazioni, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 10 4 geq/ml Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata: In quattro campioni il carico virale è risultato superiore al valore soglia predefinito di 10 4 geq/ml Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

26 Ricerca di Parvovirus B19 I pool contaminati da Parvovirus B19 ad un valore superiore a 10 4 geq/ml sono risultati infettanti in esperimenti di infezione in vitro di cellule KU812Ep6, come dimostrato mediante ibridazione in situ, PCR e RT-PCR per la ricerca di acidi nucleici virali Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

27 Sviluppo di una tecnica di PCR real-time competitiva:  Amplificazione in unica reazione del bersaglio virale e di un bersaglio competitore  Rivelazione dei prodotti di PCR mediante coppie di sonde con emissione di segnali FRET e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point  Quantificazione assoluta mediante curve di calibrazione esterne Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Ricerca di Parvovirus B19 ITR IR ITR NS VP Competitore Coppie di sonde oligonucleotidiche e emissione di distinti segnali FRET

28 Virus Comp Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Ricerca di Parvovirus B19 Amplificazione del bersaglio virale e del bersaglio competitore Reazione di amplificazione Efficienza della reazione: E Virus = E Comp = 1.98 Errore standard: 0.06;R 2 : 1.00; Effetto competitivo Amplificazione inibita in presenza di 1 Log in eccesso del bersaglio competitore Ad equimolarità,  Cp Virus-Comp = – +0.90

29 Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19:  L’utilizzo di un bersaglio di riferimento come controllo analitico consente un monitoraggio sia delle fasi pre-analitiche che analitiche  La quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto e la normalizzazione rispetto ad un bersaglio di riferimento eterologo consentono di minimizzare gli errori nella valutazione quantitativa  La quantificazione assoluta mediante real-time competitiva risente in maniera sensibile degli effetti di interferenza reciproca, ma può consentire uno screening rispetto ad un valore soglia prefissato Conclusioni (1) Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

30 Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19:  La determinazione quantitativa del carico virale in campioni di sangue periferico consente di caratterizzare con maggior precisione il processo infettivo e di seguirne lo sviluppo nel tempo  In prospettiva, la valutazione quantitativa dell’espressione virale in campioni tissutali può consentire di definire il ruolo patogenetico del virus in numerose situazioni di rilevanza clinica  La diffusione del virus nella popolazione e la sua presenza nel sangue per periodi di tempo anche prolungati portano ad un rischio di trasmissione del sangue per via ematica: la valutazione quantitativa permette di discriminare i campioni di plasma con carico virale contaminante superiore al valore soglia di sicurezza Conclusioni (2) Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

31 Famiglia Papillomaviridae Genere Papillomavirus > 100 distinti genotipi DNA bicatenario  8000 nucleotidi Struttura icosaedrica Privo di pericapside Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Caratteristiche molecolari dei Papillomavirus

32 Infezione da Papillomavirus Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus LCRE6/E7E1/E2E4E5L1L2 Inibizione trascrizione di E6/E7 Replicazione DNA Fattori cellulari Particelle virali complete Differenziamento cellulare

33 Infezione da Papillomavirus Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus TRASFORMAZIONE IMMORTALIZZAZIONE Blocco inibizione di E6/E7 LCRE6/E7E1/E2E4E5L1L2 Integrazione

34 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR:  Rivelazione del DNA di un ampio spettro di genotipi mediante reazioni di amplificazione che utilizzano coppie di primer di consenso  Tipizzazione del genotipo virale mediante sonde oligonucleotidiche specifiche per i diversi genotipi  Valutazione della persistenza dell’infezione da genotipi di HPV ad alto rischio oncogeno  Determinazione della carica virale e dello stato fisico che assumono rilevanza:  In caso di persistenza dell’infezione per valutare il rischio oncogeno  Nel follow up di pazienti conizzate per CIN di alto grado per identificare i casi di infezione persistente dopo il trattamento Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus

35 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:  Metodi quantitativi che utilizzano pool di primer in grado di definire la carica virale di un ampio spettro di genotipi, in relazione al numero di cellule presenti nel campione, e che consentono la successiva genotipizzazione virale PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA  Metodi quantitativi genotipo-specifici per la valutazione della carica virale di HPV16 e HPV18 PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 e HPV18  Metodi quantitativi genotipo-specifici per la definizione dello stato fisico di HPV16 e HPV18 PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 e HPV18 Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus

36 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus PCR Real Time di consenso:Amplificazione con pool di primer (MGP5Bio/MGP6) e marcatura dell’amplificato con Biotina Genoma HPV MGP5 Bio MGP6 E6E7E1 E2 E4E5L2 L1 150 bp BIO La quantificazione avviene mediante interpolazione su curve di calibrazione esterna, sia per il bersaglio virale (HPV) sia per il bersaglio cellulare (GAPDH) utilizzato per la normalizzazione

37 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Genotipizzazione in ELISA:Cattura dell’amplificato su pozzetti streptavidinati e tipizzazione mediante l’utilizzo di sonde specifiche per HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58 amplificato BIO streptavidina POD Ab anti-DIG POD sonda DIG genotipo specifica ABTS sonde HPV A B C Amplificati

38 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus 2° trattamento di conizzazione  Le pazienti che hanno un’alta carica virale iniziale e mostrano un decremento della carica virale dopo il trattamento risolvono spontaneamente l’infezione

39 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus 2° trattamento di conizzazione  Le pazienti che hanno una bassa carica virale iniziale e mostrano una carica virale costante dopo il trattamento non risolvono spontaneamente l’infezione e mostrano una persistenza/recidiva della lesione

40 Ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus CARICA VIRALE HPV 16STATO FISICO HPV 16  La carica virale e lo stato fisico di HPV 16 sono importanti parametri per la valutazione del rischio oncogeno in pazienti con infezione persistente  Nelle infezioni persistenti il DNA virale può integrarsi nel genoma umano, con interruzione dei geni E2/E1e conservazione dei geni E6/E7  DNA di HPV 16 episomiale: E2/E6 = 1  DNA di HPV 16 misto: 1< E2/E6 < 0  DNA di HPV 16 integrato: E2/E6 = 0

41 Costruzione delle curve standard per E6 e per GAPDH La quantificazione del bersaglio virale E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare della rispettiva curva standard, normalizzata sul valore corrispondente per GAPDH Ricerca di Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus CARICA VIRALE: espressa come numero di copie di E6 per copie di GAPDH CURVA STANDARD E6CURVA STANDARD GAPDH

42 Costruzione delle curve standard per E2 e per E6 La determinazione del rapporto E2/E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare delle rispettiva curve standard Ricerca di Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus STATO FISICO: espressa come rapporto di numero di copie E2/E6 CURVA STANDARD E2CURVA STANDARD E6

43 Ricerca di Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus E6 HPV 16 plasmid Full length HPV 16 plasmid E2 gene copies E6 gene copies Due cloni plasmidici sono stati utilizzati per valutare sperimentalmente i diversi valori del rapporto E2/E6, nell’intervallo relativo a copie di E6 La PCR real-time può distinguere lo stato misto dallo stato episomiale quando più del 20% del DNA virale è allo stato integrato È possibile costruire una retta di regressione lineare per distinguere lo stato episomiale dallo stato misto in funzione del numero di copie di E6

44 Ricerca di Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus STATO EPISOMIALE STATO MISTO Risultati dell’analisi per carica virale e stato fisico in 68 campioni citologici positivi per HPV 16 DNA – distribuzione dei valori quantitativi attorno alla retta di regressione dei valori di cut-off

45 Ricerca di Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Stato fisico e carica viraleLesione e carica virale EPISOMALE MISTO INTEGRATO 29.4% 54.4% 16.2% LSIL HSIL IA1 22.0% 69.2% 8.8% Una elevata carica virale aumenta la probabilità di integrazione di HPV 16 nel genoma umano e rappresenta un fattore di rischio per la progressione a carcinoma invasivo Le cellule con DNA virale integrato acquistano un vantaggio di crescita sulle altre cellule infettate, si ha una selezione dei cloni cellulari con DNA integrato, un abbassamento della carica virale e una progressione della lesione

46 Ricerca di Papillomavirus Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Lesione e stato fisico La percentuale di DNA virale totalmente episomiale diminuisce con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL) La percentuale di DNA allo stato misto aumenta con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL) DNA virale totalmente integrato è presente solo in lesioni di alto grado (HSIL) e nei carcinomi invasivi

47 Conclusioni (3) Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:  L’andamento della clearance virale nel corso del follow up è indicativo della risoluzione o persistenza dell’infezione e quindi della possibile persistenza o recidiva della lesione  Il decremento della carica virale conduce a risoluzione dell’infezione  Il mantenimento della carica virale indica una persistenza dell’infezione  La carica virale e lo stato fisico del DNA di HPVassumono rilevanza:  Un’alta carica virale è associata allo stato episomiale di HPV16  Una bassa carica virale è associata allo stato integrato di HPV16  La quantificazione del DNA di HPV nello stato episomiale vs. integrato può assumere rilevanza nella valutazione del rischio oncogeno Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus

48 Università di Bologna Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale Sezione di Microbiologia Monica Musiani Marialuisa Zerbini Giorgio Gallinella Giovanna Gentilomi Elisabetta Manaresi Francesca Bonvicini Stefania Delbarba Claudia Filippone Simona Venturoli Simone Ambretti Monica Cricca


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