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1 Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisi Giampaolo Tommasi A.C.R.A.F. S.p.A. Angelini Farmaceutici Sviluppo Farmaceutico

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1 1 Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisi Giampaolo Tommasi A.C.R.A.F. S.p.A. Angelini Farmaceutici Sviluppo Farmaceutico

2 2 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Introduzione Aspetti normativi:linee guida ICH, FDA, Emea Aspetti normativi:linee guida ICH, FDA, Emea Finalità studi di validazione Finalità studi di validazione Come sviluppare un metodo analitico HPLC:caso pratico Come sviluppare un metodo analitico HPLC:caso pratico Risultati di una validazione Risultati di una validazione Convalida analitica e specifiche di prodotto Convalida analitica e specifiche di prodotto Approfondimenti: Approfondimenti: Stress test - normative Stress test - normative Finalità studi di degradazione Finalità studi di degradazione Considerazioni generali sulla degradazione Considerazioni generali sulla degradazione Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco Conclusioni Conclusioni

3 3 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Perché validare un metodo di analisi Perché validare un metodo di analisi Misurare una caratteristica o proprietà di un prodotto Titolo principio attivo Contenuto di impurezze pH di una soluzione (es. collirio) Stabilire quanto è attendibile la misura ottenuta VALIDARE = pesare quanto vale

4 4 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Normative sulla validazione: FDA Normative sulla validazione: FDA The FDA is responsible for protecting the public health by assuring the safety, efficacy, and security of human and veterinary drugs, biological products, medical devices, our nation’s food supply, cosmetics, and products that emit radiation. The FDA is also responsible for advancing the public health by helping to speed innovations that make medicines and foods more effective, safer, and more affordable; and helping the public get the accurate, science-based information they need to use medicines and foods to improve their health.

5 5 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Normative sulla validazione: FDA Normative sulla validazione: FDA  Reviewer Guidance - Validation of Chromatographic Methods  Guidance for Industry - Analytical Procedures and Methods Validation - Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation

6 6 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Normative sulla validazione: Emea Normative sulla validazione: Emea European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the European Union with headquarters in London. Its main responsibility is the protection and promotion of public and animal health, through the evaluation and supervision of medicines for human and veterinary use. The EMEA coordinates the evaluation and supervision of medicinal products throughout the European Union. The Agency brings together the scientific resources of the 25 EU Member States in a network of 42 national competent authorities. It cooperates closely with international partners, reinforcing the EU contribution to global harmonisation.

7 7 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI  CVMP/VICH/590/98-Topic GL1 >>  CVMP/VICH/590/98-Topic GL1 >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Definitions and Terminology  CVMP/VICH/590/98-Topic GL2 >>  CVMP/VICH/590/98-Topic GL2 >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Methodology Normative sulla validazione: Emea Normative sulla validazione: Emea

8 8 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Normative sulla validazione: ICH Normative sulla validazione: ICH The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) is a unique project that brings together the regulatory authorities of Europe, Japan and the United States and experts from the pharmaceutical industry in the three regions to discuss scientific and technical aspects of product registration. The purpose is to make recommendations on ways to achieve greater harmonisation in the interpretation and application of technical guidelines and requirements for product registration in order to reduce or obviate the need to duplicate the testing carried out during the research and development of new medicines. The objective of such harmonisation is a more economical use of human, animal and material resources, and the elimination of unnecessary delay in the global development and availability of new medicines whilst maintaining safeguards on quality, safety and efficacy, and regulatory obligations to protect public health

9 9 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Normative sulla validazione: ICH Normative sulla validazione: ICH  Q2A >>  Q2A >> Text on Validation of Analytical Procedures  Q2B >>  Q2B >> Validation of Analytical Procedures: Methodology

10 10 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Linea guida ICH Q2A Linea guida ICH Q2A Identificaz Test di validazione Precisione Accuratezza Specificità Linearità Intervallo Limite di detection (LOD) Limite di quantificazione Robustezza Test di efficienza del sistema Quantitativa Impurezze

11 11 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso praticoTEST REPORT PIANO DI STUDIO

12 12 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Attività Attività Produzione di lotti pilota >> Produzione di lotti pilota >> secondo quanto indicato nel dossier Transfert method >> Transfert method >> test statistico Documenti >> Documenti >> emissione di certificato analitico PRODOTTO >> PRODOTTO >> Gel a base di Diclofenac sodico SCOPO DELLO STUDIO >> SCOPO DELLO STUDIO >> Trasferimento sito produttivo DOCUMENTAZIONE >> DOCUMENTAZIONE >> Dossier farmaceutico

13 13 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico VALUTAZIONE METODO DI ANALISI Condizioni analitiche Colonna Colonna : LiChrospher RP Select B M.Ph. M.Ph. >> 50% MeOH - 50% Tampone fosfato Conc. Diclofenac >> 0.25 mg/ml Vol. inj. Vol. inj. >> 20 µl (5µg diclofenac) Flow rate Flow rate >> 1.7 ml/min pH pH >> 4.3 circa >> 282 nm Temperatura Temperatura >> 40°C t R = 20,447 min  = 1.51 (  = a/b) N = 3241 Width = 0,8467 min

14 14 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico VALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICI Lunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (t R = 20,447 min.) Lunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (t R = 20,447 min.) Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione (  = 1,5) Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione (  = 1,5) Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241) Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241)CONCLUSIONI Picchi con la pancia >> analisi problematica Picchi con la pancia >> analisi problematicaDECISIONE Rivalidazione metodo di analisi Rivalidazione metodo di analisi

15 15 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico PIANO DI STUDIO >> Informazioni Cosa misuriamo >> Analisi quantitativa diclofenac Come misuriamo>> Tecnica Cromatografica Principi chimico - fisici>> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer Campo di applicazione>> Rilascio lotti (SI) >> Studi di stabilità (SI) >> Convalida di processo (SI) >> Cleaning validation (NO)

16 16 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico PIANO DI STUDIO >> Informazioni Chimica sost.esame>> Impurezze e prodotti di degradazione Metodi noti>> Diclofenac in collirio Forma farmaceutica>> Eccipienti / Gel Preparazione campione>> Solubilità sostanza in esame Tempo analisi >> Obiettivo max 10 minuti

17 17 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico CHIMICA DICLOFENAC SODICO fonte Farmacopea Europea

18 18 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico FORMULATO PRODOTTO fonte Dossier farmaceutico Formulato Diclofenac sodico >> 1 g Copherol F 1300>> 1 g Carbopol 980 >> 1.50 g Ammoniaca Sol 10%>> 2.60 g Cetiol V>> 0.50 g Phospholipon 80 >> 2.00 g Titriplex III >> 0.04 g Eutanol G>> 0.50 g Aroma “Vert de Creme”>> 0.02 g Alcool Isopropilico g >> 20.17g Acqua dem.ta >> q.b. a 100 g Analisi Alto contenuto massa gelificante Alto contenuto massa grassa Phospholipon 80 >> effetto matrice Profumo “Vert de Creme” (mix) Verifiche Doppia diluizione >> riduzione interf. Intervallo tra µg >> no sovracarico Analisi placebo Phospholipon 80 Analisi spettrale

19 19 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Doppia diluizione: verifiche con vari solventi Doppia diluizione: verifiche con vari solventi Ipotesi Ipotesi : solvente che aprisse la matrice gelificante (senza solubilizzarla) Obiettivo Obiettivo : estrarre il P.A. senza modificare la sua ionizzazione Sperimentale Sperimentale : Solventi di estrazione >> MeOH MeOH - ACN - Fase Mobile - Isopropanolo Prove rispetto al Phospholipon Prove rispetto al Phospholipon Ipotesi Ipotesi : possibile “effetto matrice” Obiettivo Obiettivo : Verificare possibile interferenza con il Phospholipon Sperimentale Sperimentale : Campione con Phospholipon >> 102.4% Campione senza Phospholipon >> 103.7%

20 20 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico VALUTAZIONE METODI ANALOGHI Condizioni analitiche Colonna Colonna : LiChrosorb RP18 M.Ph. M.Ph. >> 60% MeOH - 40% Tampone fos.to (0.5M) + NaOH 1N Conc. Diclofenac >> 0.20 mg/ml Vol. inj. Vol. inj. >> 10 µl (2 µg diclofenac) Flow rate Flow rate >> 1.0 ml/min pH (magg. 7,0) pH = alcalino (magg. 7,0) >> 278 nm Temp. Temp. >> 25°C RIFERIMENTO t R = 7,141 min  = 0.86 (  = a/b) N = 4480 Widh = 0,2511 min SAMPLE t R = min  = 1.37 (  = a/b) N = 1621 Widh = 0,4933 min

21 21 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI Condizioni analitiche Colonna Colonna : LiChrospher RP Select B M.Ph. M.Ph. >> 50% ACN - 50% Tampone ac.to + N(Et) M Conc. Diclofenac >> 0.08 mg/ml Vol. inj. Vol. inj. >> 5 µl (0,4 µg diclofenac) Flow rate Flow rate >> 1.0 ml/min pH ( 6,5 circa) pH = ( 6,5 circa) >> 282/(220) nm Temp. Temp. >> 28°C SAMPLE in MeOH

22 22 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - Valutazioni Dati cromatografici Tempo ritenzione (t R ) Simmetria (  ) Efficienza (N) Base picco Metodo originale 20,447 min.  = 1,51 N = ,8467 min. Metodo ottimizzato 4,167 min.  = 0,89 N = ,1 min.

23 23 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico SPECIFICITA’ SCOPO DEL TEST: Misurare la sostanza in esame in presenza di sostanze potenzialmente interferenti TIPOLOGIE TEST Identificazione  Il metodo analitico deve identificare selettivamente l’analita Dosaggio  Il metodo analitico deve dosare selettivamente l’analita Purezza  Il metodo analitico deve interagire selettivamente con l’analita

24 24 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico RANGE E LINEARITA’ 100% Risposta Risposta Concentrazione 100%

25 25 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico RANGE E LINEARITA’ Test validazione Range Coeff. correlazione Pendenza Intercetta Metodo originale 4,0 - 6,0  g 0, Metodo ottimizzato 0,2 - 0,6  g 0, ,37 - 5,13

26 26 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico RANGE E LINEARITA’ Confronto intercette tabulato 2.14 >> sperim Confronto pendenze tabulato 2.14 >> sperim Confronto intercetta retta standard con lo zero tabulato 2.14 >> sperim Confronto intercetta retta ricostituito con lo zero tabulato 2.14 >> sperim. 1.13

27 27 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico ACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZA ACCURATEZZA Recupero >> -0.71% PRECISIONE CV% >> 1.01% Errore sistematico del metodo di analisi Errore casuale del metodo di analisi Test di Efficienza t R >> tra 4.0 e 4.8 min  >> tra 0.8 e 1.0 N >> maggiore 8000 Rs >> non indicabile CV% area >> inf. 2.0% VALIDARE = pesare quanto vale

28 28 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso praticoCONCLUSIONI pH fase mobile Eluizione pH-dipendente % Modificatore organico ACN sostituisce MeOH Temperatura Da 40°C a 28°C

29 29 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico SPECIFICHE: Prodotto vs. Validazione ACCURATEZZA Recupero >> -0.71% PRECISIONE CV% >> 1.01% Specifiche prodotto Rilascio lotti >> 95% - 105% Studi stabilità>> 95% - 105% 95%100%105%

30 30 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Stress Test >> introduzione Aspetti normativi Aspetti normativi Finalità studi di degradazione Finalità studi di degradazione Considerazioni generali sulla degradazione Considerazioni generali sulla degradazione Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco  Temperatura / Umidità  Luce  pH  Agenti ossidanti Conclusioni Conclusioni

31 31 Aspetti normativi Stress Test come voce di glossario [rif. ICH Q1A] Stress Test come voce di glossario [rif. ICH Q1A] Stress Test come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R] Stress Test come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R] Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B] Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B] Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A] Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A] Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02] Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02] VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

32 32 Aspetti normativi alcune considerazioni …. Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1 Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1 Non è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezze Non è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezze Non è necessario effettuare studi cinetici Non è necessario effettuare studi cinetici I risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supporto I risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supporto Ampia libertà nella conduzione dei test Ampia libertà nella conduzione dei test VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

33 33 Scopo studi di degradazione Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A. Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A.   Verificare le caratteristiche intrinseche di stabilità di un principio attivo  Mettere in evidenza quali fattori provocano la degradazione del principio attivo  Prevedere accorgimenti necessari nello sviluppo formulativo di un prodotto  Valutare le misure necessarie da adottare al fine di proteggere il prodotto  Sviluppo e convalida della più adatta procedura analitica  Anticipare il comportamento del prodotto finito durante gli studi di stabilità VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

34 34 Cosa occorre? Piano sperimentale corretto: Piano sperimentale corretto: Personale qualificato Personale qualificato  Conoscenza della chimica organica di degradazione  Conoscenze analitiche della sostanza in esame  Interpretazione dei risultati  Caratteristiche strutturali della molecola in studio  Durata del piano deve avere carattere predittivo  Tipologia dei test per favorirne la degradazione VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

35 35 Degradazione: considerazione generali MOLECOLA DURATA TEST VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

36 36 Degradazione: la molecola Caratteristiche strutturali Caratteristiche strutturali Forma farmaceutica Forma farmaceutica Gruppi funzionali vs principali reazioni di degradazione Ampio ventaglio di principi attivi Eccipienti Impurezze presenti in materie prime VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

37 37 Degradazione: durata dei test Esempio: reazione consecutiva di 1° ordine Esempio: reazione consecutiva di 1° ordine P.A.BC k1k1 k2k2 Aspetti generali Aspetti generali Carattere predittivo Raggiungere il % di degradazione VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

38 38 Degradazione: durata dei test VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

39 39 Tipologia dei test Tipologia dei test Stato Solido: Esposizione Temperatura-Umidità Esposizione Luce Stato Liquido: Esposizione Luce Esposizione pH Esposizione agenti ossidanti Aspetti generali Aspetti generali Verificare vari fattori ambientali Replicare i processi degradativi Degradazione: caratteristiche test VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

40 40 Test >> Temperatura - Umidità Aspetti normativi Aspetti normativi It should include the effect of temperatures (… 50°C - 60°C)… and humidity (75%RH or greater) where appropriate … Campioni analitici Campioni analitici Principi attivi - Miscele (p.a. + eccipienti) - Formulati Direttamente esposti [rif. Q1A_R2] Principali processi degradativi Principali processi degradativi Idrolisi - Decarbossilazione - Ossidazione - Pirolisi (?!?) Polimorfismo VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

41 41 Test >> Temperatura - Umidità Durata ?? >> piccola considerazione termodinamica Durata ?? >> piccola considerazione termodinamica Ea  22 kcal  mol -1 Eq. Arrhenius k = A e -Ea/RT T = 60°C T = 25°C k (60°C) /k (25°C)  gg; (T= 60°C)  4,9 aa; (T=25°C) P.A.BC k1k1 k2k2 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

42 42 Test >> Temperatura - Umidità Alcune considerazioni sulla degradazione in fase solida Alcune considerazioni sulla degradazione in fase solida Formazione interfaccia solido-liquido (soluzioni sovrasature) Principio attivo o eccipienti a basso punto di fusione Eccesso di solventi residui da processi di granulazione Assorbimento di umidità (sostanze igroscopiche) Acqua di idratazione VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

43 43 Esposizione Temperatura - Umidità Esposizione Temperatura - Umidità Condizioni : temperatura >>50° - 60°C umidità>>75% - 85% RH Durata :60 giorni Controlli : giorni Protocollo di studio VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

44 44 Test >> Luce Aspetti normativi Aspetti normativi Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of photolysis on the active substance. Rif. linea guida Q1B: condizioni sperimentali Durata ?? Durata ?? Scopo del test >> forzare la degradazione Tempo almeno doppio delle condizioni del test di conferma VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

45 45 Test >> Luce P.A.P.A.* h Fosforescenza/Fluorescenza Emissione calore Dimerizzazione Prodotti di degradazione fotoliticifotossidazione Fotodegradazione Fotodegradazione Esempio >> dimerizzazione Esempio >> dimerizzazione h VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

46 46 Test >> Luce Esempio >> prodotti di degradazione - fotolisi Esempio >> prodotti di degradazione - fotolisi Esempio >> prodotti di degradazione - fotossidazione Esempio >> prodotti di degradazione - fotossidazione Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE) Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE) h h Metoxarato VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

47 47 Esposizione luce Esposizione luce Condizioni - Stato solidoStato liquido Secondo ICH Q1B (forced degradation) Durata : giorni3 giorni Controlli : (7 - 10) giorni giorni Protocollo di studio VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

48 48 Test >> pH Aspetti normativi Aspetti normativi …should also evaluate the suscettibility of active substance to hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or suspension …should also evaluate the suscettibility of active substance to hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or suspension … Campioni analitici Campioni analitici Classico schema a tre punti di pH Principali processi degradativi Principali processi degradativi Idrolisi - degradazioni pH catalizzate VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

49 49 Test >> pH Esempio Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con uno schema a tre punti di pH VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

50 50 Test >> pH Esempio: Hydrochlorothiazide VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Andamento degradativo che richiede uno schema di studio a più di tre valori di pH

51 51 Test >> pH Esempio: Chlorothiazide VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Interessante caso di processo di degradazione multiplo strettamente legato ai valori del pH

52 52 Esposizione pH Esposizione pHCondizioni Ambiente Acido >> Soluzione HCl 0,1 M Ambiente Neutro >>Sol.Tampone pH ~ 7 Ambiente Alcalino >>Soluzione NaOH 0,1M Temperatura >>50°- 60°C Conc. P.A. >>0,1 – 1,0% Durata : giorni Controlli : ( ) giorni Note ulteriori test in range più definito Protocollo di studio VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

53 53 Ossidazioni Aspetti normativi Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of oxidation... on the active substance. Considerazioni generali Ossigeno molecolare O 2 >> stato fondamentale tripletto Reazioni di ossidazione >> procedono via radicalica RH + O 2 ROO VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

54 54 Ossidazioni Meccanismo di reazione “Autossidazioni” Iniziazione (R i ) RH + InR + InH Iniziazione (R i ) R + O 2 ROO Propagazione (K p ) ROO + RHROOH + R Propagazione (K p ) Terminazione (K t ) 2 ROOProdotti inerti Terminazione (K t ) VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

55 55 Ossidazioni Uso di iniziatori radicalici 2,2’-azobis( 2-metilpropanonitrile) [AIBN] VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

56 56 Ossidazioni VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

57 57 Ossidazioni Esempio: Tetrazepam - degradazione VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

58 58 Ossidazioni Esempio: Tetrazepam - cromatografia VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

59 59 Ossidazioni Esempio: Tetrazepam - effetto solvente SOLVENTE AcetonitrileSecoP.A.ChetoIdropEpox1,9% 65,8% 11,2%8,4%2,8% Acetonitrile + 20% H 2 O1,4%68,1%11,4%9,6%2,8% Metanolo2,4%75,2%6,6%8,3%1,8% Etanolo5,2%84,0%1,0%6,3%tracce 2-propanolo 4,8%89,6%0,3%4,3%tracce VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

60 60 Ossidazioni Uso di perossido di idrogeno H 2 O 2 >> alcune considerazioni I risultati devono essere adeguatamente interpretati Meccanismo di azione ionico Epossidi e N-ossidi Esempio: Tetrazepam & Benzidamina HCl H2O2H2O2 H2O2H2O2 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

61 61 Ossidazioni Uso di ioni di metalli Fe 3+ ; Cu 2+ Possibili iniziatori Possono essere presenti in tracce (impurezze di materie prime e confezionamenti) Prodotti sensibili all’ossidazione Interpretazione dei risultati azo-derivati più predittivi H 2 O 2 predittiva per Epossidi e N-ossidi Attenzione se il prodotto è sensibile a tutti i test VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

62 62 Ossidazioni OssidazioniCondizioni Reagenti >> Substrato + AIBN (1:1 mol) Substrato + tracce ioni metalli (Fe 3+ o Cu 2+ ) Substrato + H 2 O 2 (sol. 3%) Solvente >>ACN ( + acqua) Temperatura >> 40°C (max) Durata :48 ore Controlli :ogni 24 ore Protocollo di studio VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

63 63 Conclusioni (1) Lo stress test è predittivo quando mette in evidenza tutte le impurezze che si possono osservare nella stabilità a lungo termine ed accelerata. Uno stress test predittivo permette di qualificare un metodo come “stability indicating”. Un test è predittivo quantitativamente quando permette di anticipare una stabilità critica. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

64 64 Conclusioni (2) I saggi di degradazione forzata sono semplici, ma devono essere interpretati da esperti. L’arricchimento delle impurezze nella degradazione forzata ne facilita l’isolamento e la caratterizzazione. Non è necessario identificare tutte le impurezze osservate nello stress test. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

65 65 Conclusioni (3) La convalida di un metodo analitico comprende i test di specificità, linearità, accuratezza, precisione, robustezza A meno di non avere informazioni esaurienti dal produttore, va sempre effettuato un test di stress della materia prima. Inoltre va verificato anche il comportamento del prodotto finito alle comuni condizioni di stress (compatibilità con eccipienti). Occorre prevedere nel metodo una sezione di calcolo per le impurezze incognite (ICH Q3B(R)). VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

66 66 Precisione La precisione di un metodo analitico esprime la vicinanza (grado di dispersione) tra una serie di misurazioni ottenute da vari campionamenti di un medesimo campione omogeneo secondo le condizioni prescritte. La precisione può essere considerata a tre livelli: ripetibilità, precisione intermedia, e riproducibilità. ripetibilità precisione intermediae riproducibilità La precisione dovrebbe essere investigata utilizzando un “prodotto finito” omogeneo. Comunque, se non è possibile ottenere un campione omogeneo, può essere investigata usando un campione preparato artificialmente o un campione in soluzione. La precisione di un metodo analitico è di solito espressa come la varianza, la deviazione standard o il coefficiente di variazione della serie di misurazioni. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

67 67 Accuratezza L’accuratezza di un metodo analitico esprime la differenza tra il valore convenzionalmente accettato come vero o come valore di riferimento e quello trovato Può a volte essere definita “esattezza” VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

68 68 Specificità La specificità è la capacità di valutare inequivocabilmente l’analita in presenza di componenti di cui può essere prevista la presenza. Tipicamente questi potrebbero includere impurezze, degradati, matrici, etc. La mancanza di specificità di una singola procedura analitica può essere compensata da altre procedure di sostegno. Questa definizione ha le seguenti implicazioni: 1.Identificazione: per accertare l’identità di un analita 2.Prove di purezza: per accertarsi che tutte le procedure analitiche effettuate permettano una dichiarazione esatta del contenuto delle impurità di un analita, i.e. prova delle sostanze correlate, metalli pesanti, contenuto dei solventi residui, etc. 3.Analisi (contenuto o efficacia): per fornire un risultato esatto che permette una dichiarazione esatta sul contenuto o sull’efficacia dell’analita in un campione. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

69 69 Linearità La linearità di una procedura analitica è la relativa capacità (all’interno di un certo intervallo) di ottenere dei risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita nel campione. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

70 70 Linearità VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A Legge Lambert-Beer Risposta Risposta Concentrazione L&B Generica 100%100% Se a=a’=0 e b=b’:

71 71 Intervallo (range) Il range di un metodo analitico è l’intervallo fra la concentrazione superiore e quella inferiore di analita nel campione (queste concentrazioni comprese) per cui è stato dimostrato che la procedura analitica ha un livello adatto di precisione, di accuratezza e di linearità. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

72 72 Limite di detection (LOD) Il LOD in un metodo analitico è la minima quantità di analita in un campione che può essere rilevata ma non necessariamente essere quantificato come valore esatto. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

73 73 Limite di quantificazione (LOQ) Il limite di quantificazione di una procedura analitica è la quantità più bassa di analita che può essere determinato quantitativamente in un campione con adatta precisione ed accuratezza. Il LOQ è un parametro delle analisi quantitative per i bassi livelli di composti in matrici di campioni, ed è usato particolarmente per la determinazione di impurezze e prodotti di degradazione. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

74 74 Robustezza La robustezza di una procedura analitica è una misura della relativa capacità di rimanere inalterata nonostante piccole intenzionali variazioni dei parametri del metodo e fornisce un’indicazione della relativa affidabilità durante l’uso normale. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

75 75 Test di efficienza del sistema Il test di efficienza del sistema è parte integrante di molte procedure analitiche. Il test si basa sul concetto che l’apparecchiatura, l’elettronica, le operazioni analitiche ed i campioni da analizzare costituiscono un sistema integrale che può essere valutato come tale. I parametri da stabilire nel test di efficienza del sistema dipendono dal tipo di procedura che si sta convalidando. Per informazioni supplementari vedasi le relative farmacopee. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a linea guida ICH Q2A

76 76 Ripetibilità La ripetibilità esprime la precisione nelle stesse condizioni di gestione in un breve intervallo di tempo. La ripetibilità è anche chiamata precisione di intra-analisi VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a Precisione

77 77 Precisione intermedia La precisione intermedia esprime le variazioni di intra- laboratorio : giorni differenti, analisti differenti, attrezzature differenti, etc. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a Precisione

78 78 Riproducibilità La riproducibilità esprime la precisione fra i laboratori ( studi collaborativi, solitamente applicati alla standardizzazione di metodologie). VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Ritorna a Precisione


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