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HPLC Laboratorio di Chimica Organica 2 - Prof. Cristina Cimarelli L27 - CHIMICA - AA 2014-2015.

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1 HPLC Laboratorio di Chimica Organica 2 - Prof. Cristina Cimarelli L27 - CHIMICA - AA

2 versatilità buone risoluzioni alta sensibilità non distruttiva velocità di analisi colonne riutilizzabili HPLC qualitativa & quantitativa

3 HPLC colonne impaccate con particelle di piccole dimensioni alte pressioni applicate in testa alla colonna alta efficienza High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography

4 HPLC LCHPLC Lunghezza della colonna23 cm Diametro della colonna1.2 cm Quantità di campione0.5 mL Dimensione delle particelle 100  m10  m Pressione0.5 psi400 psi Tempo3 h 10’20’ Velocità di flusso0.2 mL/min2 mL/min Risoluzioneincompletacompleta LCHPLC

5 HPLC - STRUMENTAZIONE COLLETTORE DI FRAZIONI MISURATORE DI FLUSSO PRE-COLONNA e/o COLONNA INIETTORE POMPE RISERVA DI SOLVENTE SISTEMA DI GRADIENTE RIVELATORE REGISTRATORE DATA SYSTEM psi  atm 1 psi = atm = kPa può contenere accessori per riscaldare degassare agitare il solvente o la miscela di solventi

6 HPLC - STRUMENTAZIONE REQUISITI DELLO STRUMENTO: massima resistenza alla corrosione resistenza ad alte pressioni di testa e flussi elevati volumi morti minimi in connessioni, iniettore, rivelatori velocità di flusso costante con precisione < 0.2%  t R

7 HPLC - STRUMENTAZIONE POMPA: è fondamentale per ottenere una velocità di flusso costante velocità costante riproducibilità dei t R Le pompe a pistone sono le più utilizzate, ma producono un flusso pulsato, che interferisce con i rivelatori. Di solito i cromatografi con pompe a pistone sono muniti anche di uno smorzatore di flusso. Alternativamente, per smorzare il flusso, si mettono alcuni pistoni in serie, con moti sfalsati, così da mediare l’uscita del flusso.

8 HPLC - STRUMENTAZIONE GRADIENTE eluizione isocratica composizione della fase mobile costante nel tempo gradientecomposizione della fase mobile variabile 1 pompa x ogni solvente + camera di mescolamento apparecchio di miscelazione + pompa

9 HPLC - STRUMENTAZIONE INIETTORE iniezione diretta in colonna o pre-colonna iniezione con valvole automatizzato x analisi in serie = trasferimento del campione nel loop per portarlo alla pressione di esercizio del cromatografo = la rotazione di una valvola devia il flusso della fase mobile nel loop e trasporta il campione in colonna caricamento

10 HPLC - STRUMENTAZIONE COLONNE forno termostatico ad acqua ad aria la colonna il rivelatore  proprietà dell’analita influenzate da T contiene Uso Diametro (cm) Lunghezza (cm) Quantità di campione Microanalisi  g Analisi  g Separazione mg COLONNE fasi con particelle di forma irregolare  m fasi con particelle microsferiche  m

11 HPLC - STRUMENTAZIONE RIVELATORI distruttivi non distruttivi UNIVERSALI misurano variazioni delle proprietà del’eluato dipendenti dalla composizione SELETTIVI (x classi di composti) misurano proprietà chimiche e/o fisiche del soluto SPECIFICI rivelano solo composti con determinate caratteristiche indice di rifrazione calore d’assorbimento ionizzazione di fiamma UV fluorescenza elettrochimici conduttività elettrolitica polarografici radioattività chirali

12 HPLC elevata sensibilitàmonitoraggio continuo dell’effluente della colonna versatilitàlinearità di risposta risposta a tutti i tipi di composti linea di base stabile RIVELATORE insensibilità alle variazioni di flusso e temperatura basso livello di rumore

13 HPLC SENSIBILITA’ RIVELATORE LINEARITA’ accuratezza del’analisi quantitativa RUMORE perturbazione della linea di base massima sensibilità concentrazione minima rivelabile dell’analita ASSOLUTA valore minimo della grandezza misurata che determina la deflessione a fondo scala del registratore, ad un dato valore del rumore di fondo  caratteristiche costruttive RELATIVA minima concentrazione di soluto eluito che può essere chiaramente distinta dal rumore SEGNALE/RUMORE = 2  PICCO IDENTIFICABILE

14 HPLC Tipo di rivelatore Sensibilità assoluta (rumore 1%) Sensibilità relativa Indice di rifrazione x  g/mL Assorbimento UV 5 x  - 5 x  g/mL Calore di adsorbimento 5 x  g/s Fluorescenza  g/mL Conduttività 5 x  g/mL Polarografia 2 x  g/mL Ionizzazione di fiamma  g/s RIVELATORI

15 HPLC Rivelatore a indice di rifrazione non distruttivo stabile l’indice di rifrazione del solvente cambia in presenza di un soluto risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura non è utilizzabile in gradiente Analisi di carboidrati  senza particolari cromofori  non contengono ioni  non danno fluorescenza Alcoli alifatici Prodotti di idrolisi degli amidi 

16 HPLC Rivelatore UV non distruttivo stabile assorbimento dell’analita nella regione UV-Vis risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura non è utilizzabile in gradiente  A fissa (254 nm - lampada al mercurio - più sensibile, meno versatile) solventi adeguati  A variabile ( nm - lampada al deuterio - continuo o stopped)  A diode array ( nm - lampade a deuterio o xeno spettro UV in continuo dell’eluato) identificazione dei soluti tipiche purezza = rapporto di assorbimento a diverse può essere usato con flussi pulsati (gradiente) buona linearità insensibile al flusso poco sensibile a T 

17 HPLC Rivelatore di fluorescenza composti o derivati fluorescenti più sensibile, meno versatile  scelta in base allo spettro di fluorescenza dell’analita di solito abbinato ad UV o indice di rifrazione  usato in medicina legale perché estremamente sensibile

18 HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI FASE STAZIONARIA STABILITA’ TERMICA INERZIA VERSO SOLVENTI & SOLUTI Silice non derivatizzata FASE DIRETTA isolato (più attivo) legato silossano (idrofobico) silanolo disattivato con acqua stabilità in un intervallo limitato di pH variazione dell’acidità da tipo a tipo  ritenzione di soluti acidi e basici adsorbimento irreversibile di analiti polari  silici funzionalizzate controllo stretto delle quantità di H 2 O per avere maggiore riproducibilità riequilibrio lento al cambiamento della fase mobile

19 HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI silice organosilano fase inversa +  X 3-n SiRR’ n 1 ≤ n ≤ 3 R = n-alchile, fenile, cianoalchile R’ = metile X = gruppo uscente: cloro, alcossi, dialchilammino Silice derivatizzata

20 HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI = seconda funzionalizzazione con organosilani con gruppi più piccoli (TMSCl, HMDS) legami a idrogeno interazioni dipolo- dipolo con composti polari perdita di risoluzione endcapping SVANTAGGI 2 < stabilità < pH 8 fasi polimeriche (polimeri stirene- divinilbenzene) idrolisi dei legami silossanici a bassi pH dissoluzione della silice a pH elevati gruppi silanolo: debolmente acidi

21 HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI meccanismo di ritenzione Repulsione della fase acquosa mobile piuttosto che interazione con la fase fissa IDROFOBICO SOLVOFOBICO Fasi mobili non polariFasi forti Contengono una maggior proporzione di solvente organico Fasi mobili polariFasi deboli Inducono il soluto a legarsi alla fase stazionaria tempi di ritenzione lunghi Variazioni di Ph Influiscono sui tempi di ritenzione, perché le molecole di soluto ionizzate interagiscono più fortemente con la fase mobile e vengono eluite prima.

22 HPLC SEPARATIVO dipende da cromatografia analitica risoluzionevelocità SCALA SEMIPREPARATIVA mg cromatografia preparativa risoluzionevelocità capacità di caricamento SCALA PREPARATIVA g  1 Kg diametro e lunghezza della colonna dipende da quantità di componente isolata per unità di tempo dimensioni della colonna velocità di flusso SCALA ANALITICA 1-10 mg dimensioni delle particelle densità di impaccamento industriale

23 HPLC Diametro interno 2 mm8 mm23 mm Separazione Difficile (  < 1.2) 1 mg 20 mg100 mg Facile (  > 1.2) mg mg1-5 g COLONNE

24 HPLC SEPARATIVO volumi iniettati troppo alti campioni poco solubili sovraccaricamento della colonna campioni troppo concentrati precipitazioni in colonna campioni solubili campione poco solubile nella fase mobile COSTANZA DEI VOLUMI DI RITENZIONE DI VOLUME DI MASSA effetti di dispersione il soluto si distribuisce lungo la fase stazionaria la banda si allarga sovraccaricamento della colonna


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