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Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Appunti.

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Presentazione sul tema: "Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Appunti."— Transcript della presentazione:

1 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Appunti di Microbiologia Informazioni: Prof Eugenio Debbia Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche DISC-Sezione di Microbiologia, Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova Tel: , FAX: W. Churchill

2 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Testi consigliati. Antonelli et al. Principi di Microbiologia Medica II ed. CEA 2012 La Placa Microbiologia Medica. Edises 2014 Jawetz et al. Microbiologia Medica. Piccin 2012

3 MICROBIOLOGIA Batteri Virus Miceti Protozoi e altri parassiti

4 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Microrganismi Organismi unicellulari Eucarioti Nucleo evidente con membrana Alghe Protozoi Miceti Batteri Nucleo non evidente Eubatteri Clamidie Spirochete Rickettsie Micoplasmi

5 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Cellula Eucariotica Nucleo Cellula procariotica BATTERI dimensioni

6 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Citoplasma Nucleoide Ribosomi Parete cellulare Membrana citoplasmatica Membrana citoplasmatica Reticolo endoplasmatico Ribosomi Nucleo Nucleolo Membrana nucleare Citoplasma Mitocondrio Cloroplasto STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICA a) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA plasmide

7 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Proteine Acidi nucleici Lipidi Polisaccaridi Nucleoide Ribosomi Granuli D’accumulo Parete Citoplasma Flagello Membrana Composizione: H 2 O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S e macromolecole organiche localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica

8 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini Principi di Microbiologia medica, II ed. Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

9 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

10 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

11 IL MICROSCOPIO OTTICO Vite macrometrica: è la manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco. Vite micrometrica: permette la regolazione fine della messa a fuoco. Regolatore dell’intensità luminosa: permette di variare l’intensità luminosa del campo.

12 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia COLORAZIONE semplice DELLE CELLULE PER L’OSSERVAZIONE MICROSCOPICA Strisciare la coltura su un vetrino Formando uno strato sottile Asciugare all’aria Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione Ricoprire il vetrino con colorante Risciacquare e asciugare Porre una goccia d’olio (da immersione) sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x Vetrino Olio 100x

13 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia COLORAZIONE DI GRAM (complessa o differenziale) Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 2-3 minuti Tutte le cellule si coloreranno di viola Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto Le cellule rimarranno viola Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti Le cellule Gram-positive risulteranno viola, quelle Gram-negative incolori Colorare con fucsina per 1-2 minuti G- G+ Le cellule Gram-positive (G+) risulteranno viola, quelle Gram-negative (G-) avranno una tonalità da rosa a rosso

14 La colorazione di Gram Un Gram positivoUn Gram negativoUn Gram positivo Bastoncelli Gram negativi misti a cocchi Gram positivi Cocchi Gram positivi

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16 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Colorazione di Ziehl-Neelsen (bacilli alcool-acido resistenti) Fucsina fenicata a caldo 5 m Acido solforico (20%) 30’’ Alcool 30’’ Blu di metilene 1 m

17 Batteri alcool-acido resistenti: rossi su fondo blu azzurro

18 Osservazione a contrasto di fase Un batterio (L. sakei), 400x Un lievito (S. cerevisiae), 400x Una muffa (G. candidum), 400x Un attinomicete 400x Un lievito (Y. lipolytica) 400x Una muffa (R. oligosporus), 400x

19 Osservazione in campo scuro

20 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Anatomia della cellula batterica Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano: a) glicocalice o slime b) capsula c) flagelli, pili o fimbrie d) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram- positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram) e) membrana citoplasmatica f) mesosomi g) citoplasma cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. ribosomi corpi inclusi

21 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Glicocalice Materiale stratificato intorno alla cellula Strato S: distribuzione regolare (cristallina) di sub-unità glicoproteiche Capsula: matrice fibrosa costituita da polimeri di carboidrati

22 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Flagelli Moto browniano Movimento attivo Flagello: unico filamento sprovvisto di membrana – flagellina- (diversa in specie batteriche diverse) chemiotassi

23 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia STRUTTURA DI UN FLAGELLO BATTERICO Membrana citoplasmatica Proteina Mot Periplasma Proteina Fli invertitore del motore Anello MS Peptidoglicano Anello P Anello L Uncino Flagellina Filamento Membrana Esterna LPS

24 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

25 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Pili o Fimbrie Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli, sono costituite da una proteina detta pilina che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione dei batteri ad altre cellule (patogenicità). Spesso sono codificati dai plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per l'adesività sia come pilo detto sessuale per creare un ponte citoplasmatico tra due cellule batteriche nei processi di coniugazione.

26 Morfologia delle adesine Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Type I fimbriae Afimbrial adhesin Curli

27 ADESINE BATTERICHE

28 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

29 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia La Parete (Cell-Wall) E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS) Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva

30 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Gram positiviGram negativi Peptidoglicano Membrana citoplasmatica Peptidoglicano Membrana Periplasma Membrana esterna Lipopolisaccaridi e proteine RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DELLA PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI

31 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI Acido teicoico Proteina associata alla parete Acido lipoteicoico Peptidoglicano Membrana citoplasmatica

32 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia BATTERIO GRAM NEGATIVO Membrana esterna Membrana citoplasmatica Peptidoglicano

33 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI Membrana esterna Periplasma Membrana citoplasmastica Interno Fosfolipide Peptidoglicano Lipoproteina Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Lipide APorina Esterno Lipopolisaccaride (LPS)

34 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

35 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Enzimi attivi sulla parete Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale, Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi, amidasi e peptidasi (enzimi che intervengono sulla sintesi di parete).

36 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Membrana citoplasmatica Costituita da fosfolipidi e proteine, non contiene steroli (negli eucarioti) presenta invaginazioni: i mesosomi importanti nella formazione del setto vi è attaccato il DNA in certe specie su altri mesosomi vi è un sistema di trasporto attivo (fotosintesi, azoto)

37 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Doppio strato fosfolipidico della Membrana Citoplasmatica batterica Regione idrofila Regione idrofobica Acidi grassi H2OH2O Fosfato Glicerolo Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++)

38 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia STRUTTURA DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Molecola fosfolipidica Proteine integrali di membrana Fosfolipidi Esterno Gruppi idrofilici Gruppi idrofobici Interno

39 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Membrana citoplasmatica Funzioni permeabilità selettiva e trasporto, trasporto elettroni e fosforilasi ossidativa escrezione enzimi idrolitici contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica

40 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Barriera di permeabilità Sito di ancoraggio Produzione dell’energia Previene dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle vie biosintetiche e nella chemiotassi Enzimi della catena respiratoria Mesosomi ?

41 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellula genera ATP.

42 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

43 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Lo spazio periplasmico E’ compreso tra la membrana interna e quella esterna, è riempito da un gel formato da peptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sono inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi alcalina che reagendo con substrati li rendono trasportabili all’interno. Molti di questi composti intervengono nella regolazione della pressione osmotica, per esempio, cellule che crescono in ambiente ipotonico aumentano la sintesi di oligosaccaridi.

44 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE DEI BATTERI GRAM NEGATIVI Polisaccaride O-specificoCore polisaccaridicoLipide “A” Acidi grassi saturi

45 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Struttura UNITA’ BASALE Gruppo N-acetile N-acetilglucosamina (G)Acido N-acetilmuramico (M) Legami peptidici Acido Meso diaminopimelico Legame sensibile Al lisozima L-alanina Acido D-glutammico D-alanina  (1-6)

46 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia LEGAME TRA LE UNITA’ PEPTIDICHE E GLICANICHE NELLA FORMAZIONE DELLO STRATO DI PEPTIDOGLICANO Staphylococcus aureus (Gram positivo) Scheletro del glicano Peptidi Escherichia coli (Gram negativo)

47 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

48 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) sono NOTI SEI SISTEMI di esportazione di molecole effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite (49, 100, 293). L.energia necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella faccia interna della membrana citoplasmica. Alla secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari sistemi (5).

49 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo I : la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina Complesso trimerico ABC (ADP binding cassette).one-step., cioè senza modifiche o clivaggi a livello del periplasma, composto dal trasportatore ABC. La sequenza segnale è presente nel termine C della proteina secreta. Esempio: (HlyB) + fattore accessorio (HlyD) + fattore addizionale della membrana esterna (Tol C). È responsabile della secrezione dell.emolisina HlyA dell.E. coli, dell.adenilato ciclasi (B. pertussis), leucotossina (P. haemolytica) proteasi (P. aeruginosa), e di altre tossine (107).

50 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo II : la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esterno Sistema (.two-step.) in cui avviene prima clivaggio della sequenza leader poi il passaggio, attraverso la membrana interna tramite sistema sec e/o GSP (General Secretory pathway), nel periplasma, quindi trasporto della proteina matura (troncata al termine.N) nella membrana esterna mediato da 12 proteine presenti nella membrana interna (alcune simili a proteine dei pili tipo IV ed all.apparato.export. di batteriofagi filamentosi ed alla proteina secretina del sistema III). Il canale di passaggio è proporzionato alle dimensioni delle molecole (proteasi, lipasi, fosfo lipasi, cellulasi, pectinasi) o tossine da esportare, come la 10 tossina colerica (CTx), pullulanasi di K. oxytoca, aerolisina di A. hydrophila, e tossine di diverse specie patogene appartenenti alla famiglie delle Legionelle, Enterobatteriacee, Pseudomonadacee (5).

51 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa TIPO III: Sistema (.one step.) composto da un complesso di oltre 20 proteine che si assemblano in un canale altamente regolato che attraversa la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna, a guisa di siringa munita di relativo ago da iniezione che penetra nella membrana della cellula bersaglio. Visibile al microscopio elettronico come struttura similflagellare con corpo conformato a dischi sovrapposti e l.ago di varia lunghezza a seconda della specie batterica (ad es., nm. nei coli EPEC, molto più corto nelle shigelle) (296bis). Questo sistema è usato da numerosi batteri, come: Salmonelle, Shigelle, Yersinie, E. coli EPEC e EHEC, Legionelle, Vibrioni, Aeromonas, Chlamydia spp, B. bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia (18, 37, 100, 148, 293, 294, 296bis, 353, 354). Il sistema delle Salmonelle è codificato da tre isole cromosomiche di patogenicità (Quadro3). Nelle Shigelle i geni codificanti il sistema III sono situati invece in un plasmide di 220 Kb.

52 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) TipoIV : il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente) Sistema (.two-step.) composto da circa 30 proteine (descritto prima per le IgA-1 proteasi e poi per varie adesine, invasine e tossine, fattori di motilità, siero-resistenza). È un Sistema di autotrasporto: Come funziona? 1) Viene sintetizzata una poliproteina (precursore) che poi è esportata con apparato.sec. 2) Clivaggio della sequenza leader della poliproteina da peptidasi sulla membrana citoplasmica 3) Liberazione nel periplasma della proteina matura 4) Il dominio β (poro) si inserisce nella membrana esterna ! struttura.β Barrel. o foro (conformazione proteica complessa composta da foglietti β multipli antiparalleli con due superfici amfipatiche, una idrofila e una idrofobica) 5) Traslocazione del dominio attraverso il canale verso l.esterno con clivaggio proteolitico e liberazione della proteina matura (ad es.: IgA-1 proteasi) Perché è definito.autotrasportatore.? Perché il passaggio della proteina nell.OMP (outer membrane protein) è mediato dal suo Ctermine senza bisogno di energia e di fattori accessori per il processo di traslocazione. Impiegato per la secrezione di proteine (tossine) o complessi proteine-DNA con comuni sequenze aminoacidiche nei domìni N- e C-terminali e H (o passeggero) da numerosi batteri: - Rickettsia spp. (rOmpA, B, SipT) - B. pertussis (BrkA), B. parapertussis (pertactina P70), B. bronchiseptica (TcfA), N.gonorrhoeae e meningitidis (IgA-1 proteasi) - E. coli (AIDA-1, Ag13, Esp C, Esp P, Pet, Tsh), S. flexneri (sepA, ShMu, IcsA), Serratia marcescens (Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2), H. influenzae (IgA-1 proteasi, Hap, Hia, Hsf), Moraxella catarrhalis (UspA-1, UspA-2) - Helicobacter pylori (VacA, CagA), H. mustelae (Hsr) - L. pneum

53 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo V : la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto) TIPO V: simile al tipo II in quanto usa il sistema di esportazione di tossine sec-dipendente per raggiungere il periplasma ma non abbisogna di proteine accessorie come il II e si comporta quindi da sistema autotrasportatore come il sistema IV. Usato da: B. pertussis (FHA-B), H. influenzae (proteine ad alto PM o HMVs), H. ducreyi (adesina LspA), - P. mirabilis (emolisina Hpm).

54 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo I : la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina Tipo II : la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esterno TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa TipoIV : il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente) Tipo V : la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto)

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56 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sistemi di secrezione (Gram-positivi) Le proteine elaborate nel citoplasma sono trasferite a livello di membrana citoplasmatica qui alcune proteine vettore (chaperone) mediano il passaggio attraverso la parete durante il quale la proteina si trasforma nella versione funzionale con meccanismo non noto

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58 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia FUNZIONI DEL CROMOSOMA Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basi appaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti, ciascuno dei quali determina una sequenza di aminoacidi e quindi la struttura di una proteina. Queste proteine, enzimi, componenti della membrana ecc. costituiscono le proprietà del microrganismo. Un segmento di DNA che determina un prodotto funzionale è chiamato gene. Gli eventi attraverso i quali una sequenza di nucleotidi di un gene determina una proteina sono i seguenti:

59 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia L’enzima RNApolimerasi, usando il DNA come modello, forma una singola catena poliribonucleotidica chiamata RNA messaggero (mRNA). Questo processo è noto come trascrizione. Questo mRNA ha una sequenza nucleotidica che è complementare con una delle catene della doppia elica di DNA.

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63 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente e trasferiti ad una molecola particolare di RNA chiamato RNA transfer (tRNA). Questi tRNA hanno una struttura che presenta ad una estremità una tripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremità hanno legato l’aminoacido corrispondente. La tripletta posta sul mRNA si chiama codon.

64 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia mRNA ed il tRNA vanno insieme sulla superficie del ribosoma. Il tRNA trova la tripletta complementare sul mRNA. Il ribosoma si muove sul mRNA e la sintesi procede. Il processo è noto come traduzione.

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66 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PLASMIDI I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare che si replicano autonomamente (replicon, fattori R, elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti, episomi, profagi non integrati). Codificano per funzioni non indispensabili per la cellula, ma che possono essere fondamentali in particolari ambienti. Diffusione della resistenza agli antibiotici

67 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PLASMIDI Elementi genetici extracromosomici DNA circolare, doppia elica replicazione autonoma ( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene 4500 Kb = cromosoma 1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb 1ųm = 2 Mdal

68 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PLASMIDI Classificazione Fenotipo Numero di copie Peso molecolare Frammenti di restrizione Gruppo di compatibilità Genetico e biochimico Fattori R coniugativi e non Amplificazione dei geni Batteriocine

69 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

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71 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia ENDOSPORE Diversi microorganismi (gram+), quando le condizioni ambientali diventano sfavorevoli, sono in grado di formare endospore (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sono liberate nell’ambiente. La spora è una cellula in fase di riposo, altamente resistente al calore, all’essiccamento, e agenti chimici, quando le condizioni risultano nuovamente favorevoli la spora germina e produce una cellula vegetativa.

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73 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sporulazione La sporulazione comporta la produzione di nuove strutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturali sono attivati durante il processo. Inizia con una invaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. La prespora si trova così racchiusa tra due membrane capaci di sintetizzare parete nella parte compresa tra loro. La prima struttura che appare si chiama corteccia, con internamente la parete della spora, all’esterno delle due membrane si costituisce la tunica sporale (mantello), ed oltre la tunica l’esosporio. Tutto richiede una gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico. All’interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimi vegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituenti della spora.

74 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia STADI DI FORMAZIONE DELL’ENDOSPORA Stadio 0 Stadio 1 Stadio 2 Stadio 3Stadio 4 Stadio 5 Stadio 6 Stadio 7 Cellula vegetativa Parete Membrana citoplasmatica DNA Spora in via di sviluppo Membrana interna della spora Membrana esterna della spora Core Nucleo centrale Disidratazione Esosporio Corteccia iniziale Strati corticali Esosporio Core Spora libera 7-10h

75 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Proprietà Core: contiene il nucleo, tutti i componenti della sintesi proteica ed un sistema per generare energia basato sulla glicolisi. L’energia per la germinazione è conservata in 3-fosfoglicerato piuttosto che ATP. La resistenza è dovuta in parte allo stato disidratato e alla presenza nel core di dipicolinato di calcio (intermedio nella sintesi della lisina)

76 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Proprietà Parete della spora E’ lo strato più interno di parete che circonda la MI della spora, composta di peptidoglicano (diventerà parete nella cellula quando germinerà)

77 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Proprietà Cortex E’ lo strato più spesso dell’involucro della spora, contiene peptidoglicano ma con meno legami crociati di quello usuale. Sensibile al lisozima, la sua autolisi è importante durante la germinazione.

78 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Proprietà Mantello E’ composto da proteine di tipo cheratinoso aventi molti legami disolfuro. Impermeabile agli agenti chimici.

79 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Proprietà Esosporio Lipoproteina contenente alcuni carboidrati.

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81 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Fisiologia della spora Nessun consumo di O 2 Attività enzimatiche assenti Assenza di sintesi macromolecolari Resistenti agli UV e all’essiccazione Termoresistenza: stabilità proteine (particolare stabilizzazione della struttura 2 aria e 3 aria ), Ca, acido dipicolinico  problema sterilizzazione Possono sopravvivere per decine di anni

82 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia GERMINAZIONE Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita. Attivazione Anche se posta in ambienti favorevoli la spora non germina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione, acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi. Iniziazione Una volta attivata la spora, la germinazione avviene se certi effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questo mette in azione l’autolisina che degrada il cortex. E’ assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sono degradati gli altri costituenti della spora. Crescita Si osserva un rigonfiamento all’interno (core) e quindi sintesi di nuova parete su quella già presente (parete della spora) con successiva divisione cellulare.

83 ResistenzaInattivazione  Batteri non sporigeni  80°C, 5-10 min  Sporigeni C. botulinum C. tetani Clostridi gangrena gassosa  Bollitura 330 min 90 min 30 min  Vapor acqueo 20 min, 121°C, 1 atmosfera  Calore secco 90 min, 170°C DIFFERENZE PRINCIPALI TRA ENDOSPORA E CELLULA ORIGINARIA Morfologia e dimensioni Composizione Resistenza agenti chimici e fisici Attività metaboliche


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