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1 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii BIOSENSORE : definizione ANALITA TARGET TRASDUTTORE ELEMENTO BIOLOGICO SEGNALE MISURABILE.

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1 1 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii BIOSENSORE : definizione ANALITA TARGET TRASDUTTORE ELEMENTO BIOLOGICO SEGNALE MISURABILE Membrana selettiva

2 2 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii 1. Relevance of output signal to measurement environment 2. Selectivity and repeatability 3. Sensitivity and resolution 4. Dynamic range 5. Speed of response 6. Insensitive to temperature (or temperature compensation) 7. Insensitive to electrical and other environmental interference 8. Amenable to testing and calibration 9. Reliability and Self-Checking Capability 10. Physical robustness 11. Service requirements and price 12. Life time and Reusability Requisiti di un biosensore

3 3 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii “A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi- quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element. A biosensor should be clearly distinguished from a bioanalytical system, which requires additional processing steps, such as reagent addition. Furthermore, a biosensor should be distinguished from a bioprobe which is either disposable after one measurement, i.e. single use, or unable to continuously monitor the analyte concentration”. According to a recently proposed (1999) IUPAC definition:

4 4 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Elemento biologico di riconoscimento molecolare Enzimi (biosensore catalitico) -transformazione dell’analita in un prodotto misurabile -inibizione dell’ enzima da parte dell’ analita -modifiche dell’enzima indotte dall’analita Antigene-anticorpo -legame ad alta affinità con un tracciante che produce il segnale o direttamente reazione Ab-Ag senza tracciante DNA: -reazioni di ibridazione ad alta affinità Sensori Biomimetici - molecole ad alta affinità (singole catene di anticorpi,..) - polimeri imprintati Biosensori cellulari -inibizione della vitalità cellulare(respirazione,.. -proteine di transporto di membrana -neurorecettori (producono il signale attraverso i canali ionici -cellule (batteri, lieviti,..) geneticamente modificati per esprimere l’elemento di riconoscimento molecolare (recettore, proteina di legame,..)e un gene reporter per la trasduzione in un segnale misurabile (luc, lux, GFP,..)

5 5 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Il segnale che viene prodotto dalla interazione dell’ analita con l’ elemento biologico può essere: Potenziometrico modifiche nella distribuzione delle cariche che produce un potenziale elettrico Amperometrico movimento di elettroni in una reazione redox Calorimetrico produzione o assorbimento di calore dal processo chimico Ottico assorbimento, emissione, rifrazione, “scattering”..della luce nella reazione Piezoelettrico variazioni di massa dovuti al legame dell’analita Foto-acustico,..…… BIOSENSORE : Trasduzione

6 6 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Principio dei biosensori Analyte Electric signal Enzyme Antibody Micro- Organism Cell Enzyme Antibody Micro- Organism Cell Electro-active substance pH Changes Heat Light Mass changes Electro-active substance pH Changes Heat Light Mass changes Electrode pH electrode Semiconductor Thermistor Photon counter Piezoelectric Dv Electrode pH electrode Semiconductor Thermistor Photon counter Piezoelectric Dv RECOGNITION LAYER TRANSDUCER

7 7 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Per Riassumere:

8 8 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Cenni storici del Biosensori Concetto e principio -- Leland Clark (1956) Sensore per l’ urea -- Guibault & Montalvo (1969) Glucosio - Yellow Springs Instr. Co. (1973) Termistore enzimatico – Mosbach (1974) Electrodo a microorganismi – Divis (1975) Sensore per l’ Ossigeno a fibra-ottica – Lubbers & Opitz (1975) Immnosensore – Liedberg et al. (1982) Elettrodo enzimatico – MediSense Inc. (1987) BIAcore – Pharmacia, Sweden (1990) Nanosensore – Vo-Dinh (2000)

9 9 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Potenziali campi di applicazione farmaci, residui,tossine,.. negli alimenti microinquinanti nell’acqua e nell’aria monitorare un processo biologico virus, bacteria,.. ions composti organici analiti di interesse chimico-clinico e diagnostico …………… Sistemi complementari ai sistemi analitici tradizionali con l’obiettivo principale di ottenere una risposta rapida o in tempo reale

10 10 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Elettrochimici Potenziometrici : Viene misurato il potenziale di una cella a valore di corrente zero. Amperometrici : Si misura l’Intensità di corrente dovuto ad un processo Ox-red.

11 11 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Elettrodo di riferimento Elettrodo indicatore Risultato: Differenza di potenziale Processore di segnale Biosensori potenziometrici I corrente = 0

12 12 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii E cell = E ind – E ref + E lj semplificata: E cell = K + E ind ISE (elettrodo indicatore) Elettrodo di riferimento (esterno) Membrana [a i ] campione Elettrodi ionoselettivi ISE Equazione di Nernst E cell = K RT log [a i ] campione zF log [a i ] campione E cell Curva Standard Dove: E = Potenziale elettrochimico K = costante R = Costante dei gas (8.314 joules/(mole)(°K)) T = Temp. assoluta Z = Numero di elettroni trasferiti F = Costante di Faraday (96,487 coulombs/mole di elettroni) a i = Attività della specie ionica (a i = C i f i ; dove C è la concentrazione dello ione ed f ilcoefficiente di attività. V

13 13 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Elettrodo per il Sodio Esempi di elettrodi ionoselettivi Elettrodo a vetro Variazione di carica dovuta al legame di H + alla membrana Risultato: variazione di potenziale ISFET

14 14 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Elettrodo per il Potassio Valinomicina Elettrodo per la CO 2 Esempi di elettrodi ionoselettivi

15 15 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Elettrodi ISE Miniaturizzati La superficie dell’elettrodo è costituita da un film di Ag/AgCl serigrafato e da un film che permette un traferimento efficiente di energia tra la membrana di PVC, la superficie di AgCl e la membrana ionoselettiva. L’elettrodo di riferimento è costituito da un film di Ag/AgCl. Che deve essere in contatto con una soluzione a concentrazione nota di ioni Cl - per funzionare.

16 16 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii (a) Membrana semi-permeabile (b) Biocatalizzatore (c) Membrana di vetro (d) Probe per il pH (e) Potenziale elettrico generato (f) Elettrodo interno Ag/AgCl (g) HCl diluto (h) elettrodo esterno di riferimento Esempio di biosensore potenziometrico

17 17 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

18 18 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Vantaggi Disponibilità di un elevato numero di enzimi utilizzabili. Elevata tecnologia disponibile e conoscenze scientifiche Facile installazione, misure semplici e dirette. Diverse configurazioni ( Statica, a flusso, micro ). Facile automazione e applicabilità Bassi costi. Svantaggi Scarsa selettività di alcuni biosensori. Il numero di biosensori disponibili è molto limitato Vantaggi e svantaggi dei Biosensori Potenziometrici

19 19 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii MOSFET variazione del potenziale applicato variazione di intensità di corrente Modulazione di I dal potenziale applicato

20 20 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Il corpo principale è costituito da un chip di silicio con due aree +/- tipo-n. Il chip è isolato da un film di 0.1 m di SiO 2 che forma la piattaforma del FET. Sopra vi è un film di materiale sensibile agli H+, la membrana ione selettiva, la membrana biocatalitica e quindi la soluzione contenente l’analita che è separata dalla parte sensibile del FET da un polimero inerte. Quando si applica un potenziale ai due elettrodi si avrà un passaggio di corrente attraverso il FET funzione del potenziale positivo rivelato al polo dello ione positivo. Questa corrente (I) viene confrontata con quella ottenuta con un ISFET non catalitico immerso nella stessa soluzione silicio Membrana biocatalitica Elettrodo di riferimento Membrana Iono selettiva Membrana Sensibile a H  m Transistor per misure di pH

21 21 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

22 22 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

23 23 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Immagini di alcuni Biosensori ISFET

24 24 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Elettrodo di riferimento Elettrodo di lavoro Risultato: Intensità di corrente Processore di segnale Biosensori amperometrici Differenza di potenziale prefissata

25 25 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Il biosensore amperometrico più semplice utilizza l’elettrodo ad ossigeno di Clark. Questo è costituito da un catodo di Pt al quale l’O 2 si riduce ed un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.. Ag anodo 4Ag 0 + 4Cl - 4AgCl + 4e - Pt catodo O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O Collegamento amplificatore Filo di Ag ricoperto con AgCl Tubo di plexiglas Membrana permeabile all’O 2 introduzione elettrolita KCl 100 mM Elettrodo ad Ossigeno Filo di Pt forgiato per essere sigillato da vetro ed avere una superficie piatta esposta all’analita

26 26 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii elettrodo pO 2 L’elettrodo pO 2 consiste di un catodo di platino e di un elettrode di riferimento Ag/AgCl.

27 27 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori amperometrici di I generazione I biosensori amperometrici di prima generazione monitorano il consumo di O 2 o la produzione di H 2 O 2 associate all’ossidazione di un substrato da parte di un enzima ossidasi

28 28 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii. La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi: Glucosio + FAD + H 2 O ———> Acido gluconico +FADH 2 FADH 2 + O 2 ———> H 2 O 2 + FAD La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore così l’elettrodo di lavoro compete con l’enzima per l’ossigeno molecolare. Biosensore amperometrico per il glucosio glucosio Membrana permeabile all’O 2

29 29 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Tipica risposta del biosensore amperometrico per il glucosio Biosensore amperometrico per il glucosio Misure batch Misure in flusso

30 30 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore amperometrico per il glucosio Misure FIA (flow injectio analysis)

31 31 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

32 32 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

33 33 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per monitorare la produzione di acqua ossigenata. L’acqua ossigenata è ossidata all’elettrodo di lavoro secondo la seguente reazione: H 2 O 2 —-——> O 2 + 2H + + 2e - L’enzima è immobilizzato e tenuto il più vicino possibile l’elettrodo di lavoro. E’ prodotta una corrente proporzionale alla concentrazione del metabolita da analizzare. Un fattore limitante di questi sensori è che sono dipendenti dalla solubilità dell’ossigeno nelle soluzioni campione. Biosensore ad acqua ossigenata

34 34 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

35 35 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Si utilizzano dei “mediatori” che trasferiscono gli elettroni direttamente all’elettrodo bypassando la riduzione dell’ossigeno. I ferroceni rappresentano il gruppo di mediatori più utilizzati. Biosensori amperometrici di II generazione

36 36 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori amperometrici di III generazione

37 37 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Amperometrici Vantaggi 1.Non influenzato dal drift dell’elettrodo di riferimento 2.Risposta lineare. 3.Sono più sensibili di quelli potenziometrici. E’ possibile miniaturizzarli Svantaggi 1.La corrente amperometrica consuma l’analita e la sua diffusione influenza la risposta. 2.La misura amperometrica viene eseguita ad un particolare potenziale di lavoro dove altre sostanze potrebbero reagire ed interferire. 3.Il materiale all’anodo si consuma riducendone il tempo di utilizzo, paricolarmente quando si utilizzano film sottili di Ag/AgCl.

38 38 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Sensori Piezoelectrici Microbilancia al quarzo QCM Sistemi piezoelettrici Cristallo di quarzo Elettrodo d’oro

39 39 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Microbilancia al quarzo (QCM) Modifiche nell’intorno del cristallo

40 40 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Piezoelettrici Transduttore: microbilancia cristallo di quarzo (QCM) probe immobilizato DNA Target, Ag, Ligando Si forma un duplex, Ab-Ab, Complesso lig-recettore la massa aumenta Cala la frequenza di risonanza del cristallo

41 41 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Piezoelettrici La relazione tra massa m e frequenza f è data dalla nota relazione di Sauderbery: Dove: -Δf è la variazione di frequenza (Hz), -Δ m è la variazione di massa della sostanza assorbita sulla superficie (g), - K è una costante che dipente dalla densità e dal tipo di cristallo (taglio), -A è la superficie (cm2) Cristallo di quarzo Oscillatore 10MHz Analita in soluzione

42 42 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Piezoelettrici Sensitive coating elemento biospecifico immobilizzato

43 43 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Anticorpo anti-gD IgG immobilizzato sulla bilancia QCM

44 44 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii ◊ The amount of protein deposited on the films increases with time. ◊ The protein deposition appears to reach a plateau which represents maximum absorption onto the film.

45 45 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

46 46 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

47 47 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

48 48 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Tecniche di immobilizzazione 1)Immobilizzazione fisica: operativamente semplice ma meno stabile. 2)Immobilizzazione chimica: operativamente complessa, ma più stabile Schema di reticolazione con BSA-gluteraldeide Schema di reticolazione su membrane carbossiliche con carbodimmide

49 49 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii L’obiettivo è quello di minimizzare interazioni aspecifiche e quindi sviluppare un immunosensore specifico e con il vantaggio di non utilizzare un tracciante e quindi misurare direttamente l’interazione Ab—Ag Si può utilizzare per esempio: sistema avidin-biotin, thiol-dextran, DSP, silanizzazione e assorbimento. Immobilizzazione di una proteina Sviluppo di immunosensori

50 50 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Ligando Immobilizzato Superficie del sensore Rivelatore Ottico Segnale Elettrico Processore Risultato Riconoscimento molecolare Biosensore Ottico

51 51 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore Ottico: Principi

52 52 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore Ottico: Principi

53 53 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore a fluorescenza Es: biosensori basati su esteri del boro

54 54 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

55 55 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

56 56 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore a fluorescenza DETERMINAZIONE DI SUBSTRATI ENZIMATICI

57 57 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Indirect Optical Immunosensors : FCFD Fluorescence Capillary Fill Device

58 58 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Fiber-optic cholesterol sensor Biosensore a fluorescenza

59 59 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y Laser on (( )) Capture antibody Sample applied, antigen binds to capture antibody Other cells and debris washed away Detection antibody binds to antigen and fluoresces when laser turned on. antigen

60 60 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Laser (635 nm) Evanescent wave 100 nm Waveguide >650 nm signal recovered In pAmps Excited Cy5 Evanescent Wave Technology

61 61 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii T. Vo-Dingh et al., Sensors and Actuators B, 2001 Sistema ottico per misure intracellulari

62 62 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Sistemi ottici basati di misura della luce evanescente

63 63 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori a risonanza di superficie plasmonica (SPR) SPR, fenomeno che avviene quando la luce è riflessa da un film sottile di un metallo

64 64 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

65 65 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Prism Coupler-Based SPR Sensors I. Wavelength modulation II. Angular modulation

66 66 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori a SPR: applicazioni

67 67 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii The Resonant Mirror Cuvette  (arc sec) Intensity of Resonated Light Time Vibro-stirrer in each well Prism Sample Well Resonant Mirror Low R.I. Layer Laser Detector Resonated h Coupling Layer Polariser

68 68 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore ottico ad onda evanescente n 1 > n 2

69 69 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii

70 70 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Substrati analizzabili con biosensori enzimatici

71 71 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore calorimetrico Q = –(n/M)/ΔΗ ΔΤ= Q/Cs=-n ΔΗ/M Cs

72 72 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensore calorimetrico

73 73 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori a DNA DNA a doppia elica Elettrodo di lavoro

74 74 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Tipi di biosensori a DNA

75 75 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori piezolelettrici a DNA Quartz crystal microbalance (QCM) transducers Immobilized DNA probe Target DNA Form duplex---mass increase Decrease in crystal’s resonance frequency

76 76 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Immobilizzazione del DNA sulla QCM Immobilizzazione di DNA-biotina su di un elettrodo QCM modificato

77 77 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Il DNA probe viene immobilizzato su di un cristallo piezoelettrico di quarzo ricoperto di streptavidina. La Streptavidina viene legata covalentemente ad uno strato monolayer costituito da 11-mercaptoundecanolo. Probe: oligonucleotide biotinilato Oro 11-mercaptoundecanolo Destrano Biotina (Strept)avidina Strept)avidina Tempo (sec) Frequenza Hz (Strept)avidina Probe biotinilato Attivazione con EDC e NHS Immobilizzazione del DNA sulla QCM

78 78 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Cellulari: potenziale d’azione Potenziale di azione dato dalla differenza di concentrazione di specie ioniche attraverso la membrana cellulare

79 79 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Misura del potenziale d’azione con un elettrodo Biosensori Cellulari: potenziale d’azione

80 80 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Valutazione della sensibilità ad un agente tossico Biosensori Cellulari: potenziale d’azione

81 81 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Respirazione di cellule Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici Misura della variazione di O 2 con elettrodo di Clark

82 82 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici

83 83 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori Cellulari Receptor Responsive Element LUCIFERASE Analyte Signal Biosensor

84 84 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii The Bacterial Process: Catalyst: Luciferase Decanal FMNH2 O2 Decanoic acid, FMN*, H2O, Light, (490 nm) The Firefly Process: Catalyst: Luciferase Luciferin, ATP, O2 Oxyluciferin, AMP+Ppi, Light (560 nm) Biosensori bioluminescenti

85 85 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Bioluminescence decreases in direct proportion to the level of toxicity present Light output is directly proportional to the metabolic activity of a cell Increasing Toxicity Light Output Biosensori bioluminescenti

86 86 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Active Cell Damaged Cell following exposure to toxin Normal levels of FMNH2 due to Active Respiration Bioluminescent cells Reduced levels of FMNH2 due to Reduced Respiration Bioluminescence Reduced or stopped Biosensori bioluminescenti

87 87 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Multidisciplinarietà dei biosensori

88 88 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Biosensori futuri Elemeno di bioriconoscimento

89 89 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii Ultime pubblicazioni sui biosensori

90 90 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii World Biosensor Market

91 91 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA iii


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