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TECNICHE SPETTROSCOPICHE Le tecniche spettroscopiche sono tutte quelle tecniche basate sullinterazione tra la materia e le radiazioni elettromagnetiche.

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Presentazione sul tema: "TECNICHE SPETTROSCOPICHE Le tecniche spettroscopiche sono tutte quelle tecniche basate sullinterazione tra la materia e le radiazioni elettromagnetiche."— Transcript della presentazione:

1 TECNICHE SPETTROSCOPICHE Le tecniche spettroscopiche sono tutte quelle tecniche basate sullinterazione tra la materia e le radiazioni elettromagnetiche. La luce, il calore ed altre radiazioni elettromagnetiche sono vibrazioni di campi magnetici ed elettrici che si propagano nello spazio. Ogni radiazione, o onda elettromagnetica, è caratterizzata dai parametri: Frequenza () il numero di vibrazioni nell'unità di tempo Lunghezza d'onda () distanza tra due punti adiacenti in fase (ad esempio tra due massimi consecutivi) Velocità di propagazione(c) dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione. = c/ La relazione che lega questi parametri è:

2 E utile anche considerare queste radiazioni elettromagnetiche come un treno di particelle chiamate fotoni o quanti. La di una radiazione elettromagnetica è in relazione con lenergia contenuta in un quanto mediante la relazione E = h h costante di Planck = 6.63x Joule sec ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTE PROPORZIONALI Un fascio di luce è più o meno intenso a seconda che porti più o meno fotoni nell'unità di tempo, ma l'energia di ciascun fotone (il quanto di energia), è sempre la stessa per una determinata frequenza della radiazione. La frequenza è inversamente proprorzionale alla lunghezza donda

3 Tipi di radiazione elettromagnetica Esistono quindi vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia)

4 L'analisi spettrofotometrica consiste in misurazione di radiazioni elettromagnetiche per ottenere informazioni sia qualitative che quantitative: ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda ben determinata – l'analisi dello spettro permette allora di individuare la natura della sostanza in esame – la misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di risalire alla quantità di sostanza analizzata. PRINCIPIO Atomi o molecole, trovandosi in campi energetici possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia quando atomi o molecole vengono eccitati da adatte radiazioni elettromagnetiche (hν), passando a stati energetici maggiori, si ha il fenomeno di ASSORBIMENTO quando dagli stati eccitati, ritornano allo stato fondamentale, gli atomi e le molecole emettono quanti di energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche ( hν ) si ha il fenomeno di EMISSIONE (FLUORESCENZA)

5 In genere per lassorbimento nellUV e nel Visibile (= 200–700 nm) sono interessati, nelle transizioni energetiche, gli elettroni esterni della molecola assorbente sia impegnati che non impegnati in un legame. La parte della sostanza assorbente chiamata cromoforo interessata a tali transizioni è generalmente costituita da anelli eterociclici aromatici, doppi legami coniugati, ponti disolfuri e gruppi chimici funzionali come COOH, NH 2.

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7 Analisi qualitativa: spettro di assorbimento DEF: curva ottenuta congiungendo i valori di assorbimento presi in funzione della lunghezza donda in un certo intervallo di lunghezze donda. Ogni sostanza assorbente ha un suo caratteristico spettro utile alla identificazione di tale sostanza nel campione in esame. Lunicità dello spettro consiste nella presenza di caratteristici picchi di assorbimento a determinate lunghezze donda non riscontrabili negli spettri di altre sostanze assorbenti. Un esempio è lo spettro del coenzima NAD + NADH ha due picchi, 260 e 340 nm NAD + ha un solo picco, 260 nm

8 Citocromi: REAZIONI DI TRASFERIMENTO REVERSIBILE MONOELETTRONICHE (Fe 3+ Fe 2+ ) cit. b cit. c cit. a Legame covalente (ponti tioeteri) 560nm 550nm 605nm

9 Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente a seconda della concentrazione; in altre parole l'assorbimento dipende dalla concentrazione. Analisi quantitativa I 0 lintensità della radiazione incidente I lintensità della radiazione trasmessa. Definiamo Trasmittanza T = I/I 0

10 Trasmittanza : 0 T 1 T = 1 la radiazione è completamente trasmessa I 0 = I T = 0 la radiazione è completamente assorbita I = 0 T = 10 –lc = I/I 0 log I/I 0 = -cl Definendo A (Assorbanza)= log I 0 /I A = cl Legge di Lambert Beer C = concentrazione della soluzione o specie chimica in esame (moli/litro) l = cammino ottico (ovvero spessore dello strato attraversato dalla radiazione incidente) = coefficiente di estinzione molare (ovvero lassorbimento che subisce un raggio di luce monocromatica nellattraversare una soluzione a concentrazione unitaria e cammino ottico di 1 cm)

11 Lassorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del campione: mettendo in grafico lA in funzione di c avremo una retta passante per lorigine degli assi. Se l= 1 cm la pendenza della retta data da A/c = fornisce il valore del coefficiente di estinzione molare alla considerata A c Secondo la legge di Lambert – Beer, più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà lassorbanza (maggiore sarà la diminuzione dellintensità del raggio incidente).

12 Validità della legge di Lambert-Beer: la luce incidente e monocromatica lassorbimento del solvente e trascurabile la concentrazione del campione e contenuta entro limiti adatti non si verificano reazioni chimiche delle molecole del campione fra loro o con il solvente

13 STRUMENTAZIONE: Spettrofotometro I componenti essenziali sono: Sorgente di luce policromatica (tungsteno per il visibile, deuterio per lUV) Fessura dingresso-lente (per minimizzare la luce diffusa e rendere paralleli i raggi della sorgente) Filtro o monocromatore (per selezionare una banda di definita) Fessura duscita Cella o cuvetta Fotomoltiplicatori (trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico)

14 Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzati i vari componenti: SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO SPETTROFOTOMETRI A DOPPIA LUNGHEZZA DONDA

15 Spettrofotometro a singolo raggio Questo strumento lavora ad una singola lunghezza donda selezionata; è utilizzato normalmente per effettuare analisi che prevedono misure ad una sola lunghezza donda e per soluzioni con un solo analita.

16 E presente un componente che sdoppia il raggio: è possibile avere il confronto simultaneo tra lassorbimento della cuvetta contenente il campione e la cuvetta di riferimento. E possibile effettuare misure direttamente a qualsiasi senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo spettro. Spettrofotometro a doppio raggio

17 Spettrofotometro a doppia lunghezza donda Elimina lassorbimento aspecifico ed è possibile registrare spettri differenziali per la possibilità di utilizzare due lunghezze donda, una di riferimento, laltra di misura.

18 APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA analisi qualitativa: spettro dassorbimento analisi quantitativa diretta per sostanze che assorbono ad una data lunghezza donda, tipo le proteine il cui assorbimento a 280 nm si basa principalmente sul suo contenuto di tirosina e triptofano analisi quantitativa indiretta tramite reazione colorimetrica; molte sostanze possono reagire con altre a dare un prodotto colorato. Si misura lestinzione dei campioni rispetto a quella di un bianco che contiene tutti i reagenti tranne la sostanza da determinare attività e cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento che partecipi come substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame

19 Metodo Bradford Questo metodo è semplice, rapido, economico e sensibile. Esso si basa sull'azione del Coomassie brilliant blue G-250 che si lega specificatamente a residui di arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina. Si lega a questi residui in una forma anionica, con assorbanza massima a 595 nm. Metodo del Biureto il reattivo del biureto consiste in una soluzione alcalina di solfato di rame contenente tartrato di sodio e potassio. Gli ioni rameici formano un complesso di coordinazione con 4 gruppi NH 2 ed ha un picco di assorbimento a 540 nm. Entrambi i metodi necessitano del valore di concentrazione di una proteina di riferimento, lalbumina dosata a 280nm (analisi diretta) Analisi quantitativa indiretta

20 Dosaggio enzimatico 1.Dosare la quantità di un substrato che prende parte ad una reazione catalizzata da un enzima 2.Dosare lattività di un enzima, cioè la velocità di una reazione catalizzata da un enzima Enzimi plasmatici a scopo diagnostico: un dosaggio degli enzimi nel plasma può essere utilizzato per diagnosticare il danno di un tessuto od organo particolarmente ricco in alcuni enzimi e lentità del rilascio enzimatico fornirà un indice del grado del danno cellulare. carenze/difetti enzimatici responsabili di sindromi biochimiche

21 Come si misura lattività di un enzima ? La misura della variazione di DO nel tempo è la misura della velocità di reazione. Quando si vuole misurare la velocità di una reazione enzimatica si misura la variazione di DO nel tratto iniziale : in questo intervallo il reagente si trasforma in prodotto alla massima velocità dopodichè la velocità diminuisce man mano che si instaura lequilibrio. Si misura la variazione nel tempo di una qualsiasi grandezza correlata alla concentrazione del substrato o del prodotto. Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel tempo v = - d [S] / dt = d [P] / dt DO = lc c = DO/l v = dc/dt v = 1 dDO/dt l

22 Vi = Vmax [S] / [S] + Km se [S] > > Km Vi = Vmax In quali condizioni fare i dosaggi? Per valutare lattività di un enzima si lavora in eccesso di substrato (condizioni di V max )

23 Dosaggio dell attività enzimatica (metodo diretto) Un esempio è il dosaggio della lattico deidrogenasi che catalizza la reazione:

24 Per dosare lattività della LDH si misura la velocità iniziale della reazione catalizzata dallenzima per concentrazioni di piruvato (substrato) saturanti.

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26 Si aggiunge un enzima ausiliario (LDH) e il NADH Si segue la scomparsa del NADH a 340 nm Piruvato + NADH + H + Lattato + NAD + LDH il parametro da misurare deve essere limitante tutti i substrati devono saturare lenzima Dosaggio dellattività enzimatica (metodo indiretto) Un esempio è dato dalla reazione catalizzata dalla PK

27 Dosaggio dellattività enzimatica (metodo indiretto) Un esempio è dato dalla reazione catalizzata dalla GOT (glutammico ossalacetico transaminasi (GOT) Malato DH

28 Dosaggio enzimatico del substrato Possiamo risalire al numero di moli di piruvato che vengono trasformate in lattato calcolando le moli di NADH ossidate, tenendo presente che esiste un rapporto stechiometrico 1:1 fra substrato e coenzima. A A f - A i A =lC C= A /l enzimi ed eventuali substrati devono essere in eccesso il substrato da dosare deve essere limitante

29 Elettrodo per ossigeno di Clark Misura lossigeno in una soluzione usando il principio polarografico, cioè monitorando la corrente che passa fra due elettrodi quando si applica un voltaggio.

30 La porzione superiore di tale elettrodo è costituita da una camera di reazione termostatata in cui si posiziona il campione di cui si vuole conoscere la tensione di ossigeno La porzione inferiore è rappresentata dalla camera degli elettrodi, in cui si verificano reazioni di ossido-riduzione I due compartimenti sono separati da una membrana di teflon che da una parte, permette allossigeno di diffondere verso la camera degli elettrodi

31 La camera degli elettrodi comprende un catodo di platino e un anodo dargento, entrambi immersi nella stessa soluzione satura di cloruro di potassio (KCl). Quando viene applicata tra gli elettrodi una differenza di potenziale di circa 0.6 volt, allanodo si verifica la seguente reazione di ossidazione: 4Ag + 4Cl - 4AgCl + 4e - Gli elettroni generati sono impiegati per ridurre al catodo lossigeno che diffonde attraverso la membrana, formando acqua: O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O La corrente prodotta dallelettrodo è proporzionale alla tensione dellossigeno nel campione: tale valore può essere così amplificato e registrato attraverso un tracciato continuo.

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33 Il consumo di ossigeno in vitro dipende da vari fattori: Disponibilità di ossigeno Disponibilità di substrati ossidabili Presenza di inibitori della catena respiratoria Il consumo di ossigeno in vitro permette di: Valutare lICR (indice di controllo respiratorio) Misurare il PO (efficienza di fosforilazione ossidativa) Studiare gli effetti degli inibitori

34 O 2 Tempo(min) mito substrato ADP oligomicina DNP Stato 4 Stato 3 ICR = v st3/v st4 O 2 consumato P/O = nmoli ATP prodotto / natomi di O 2 consumati

35 Piruvato/MalatoNADH Antimicina AAscorbato/TMPD Cianuro RotenoneSuccinato CIII O2O2 Cit.c CI CIV Q 10 CII [O 2 ] tempo Pir/Mal Succ Asc/TMPD Mit Rot Ant.A KCN

36 Pir/Mal Succ dig Rot Ant.A Asc/TMPD KCN DNP cells [O 2 ] tempo


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