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- Spontanee -appaiamenti vacillanti*, depurinazione, deaminazione, sequenze ripetute portano ad: errori durante la replicazione -errori durante il riparo.

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1 - Spontanee -appaiamenti vacillanti*, depurinazione, deaminazione, sequenze ripetute portano ad: errori durante la replicazione -errori durante il riparo -errori durante la meiosi -Indotte -agenti fisici:radiazioni ionizzanti, raggi UV -agenti chimici: analoghi di basi, modificatori, intercalanti -virus oncogenetici * ** MUTAZIONI

2 (fanno fronte ai diversi tipi di danno del DNA, utilizzando enzimi per compiere le correzioni) E fondamentale che le cellule possiedano dei meccanismi di riparazione del DNA che permettano di eliminare immediatamente eventuali danni spontanei o indotti che il DNA subisce continuamente, garantendo così la stabilità genetica degli individui. -CORREZIONE DI BOZZE -CORREZIONE DEGLI ACCOPPIAMENTI SBAGLIATI -RIPARO PER ESCISSIONE CORREZIONE DI BOZZE Rimozione degli errori che si verificano durante la replicazione ad opera della attività esonucleasica 3 5 della DNA- POLIMERASI. RIPARO DEL DNA

3 CORREZIONE DEGLI ACCOPPIAMENTI SBAGLIATI Rimuove gli errori di duplicazione sfuggiti all'esonucleasi di correzione. Riconosce la distorsione che è presente all'esterno dell'elica quando si affrontano due basi non complementari Per essere efficace il sistema deve essere in grado di riconoscere e rimuovere il nucleotide sbagliato soltanto sul nuovo filamento dove è avvenuto l'errore.

4 RIPARO PER ESCISSIONE 1) Escissione di nucleotidi Rimozione di un piccolo tratto di DNA contenente qualche grossa lesione (reazioni del DNA con grossi idrocarburi, dimeri di pirimidina provocati dalla luce etc…) - taglio -escissione -riempimento del tratto - ricongiunzione

5 2) Escissione di una base Rimozione di nucleotidi che producono una minore distorsione della doppia elica (basi deaminate, alchilate o ossidate, basi con anelli aperti etc..) -rimozione della base: rottura del legame glicosidico che unisce la base alla molecola di zucchero -rimozione del deossiribosio -riempimento -ricongiunzione

6 Riparo per ricongiunzione delle estremità non omologhe di DNA Si verifica quando una cellula ha subito una rottura di entrambi i filamenti di DNA (farmaci anticancro, radiazioni ionizzanti). Tali rotture possono essere riparate solo se le estremità libere del DNA sono ricongiunte esattamente. Negli organismi pluricellulari, il meccanismo di riparazione prevede la giunzione delle estremità tra molecole di DNA da parte di un complesso di proteine.

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8 Capacità di esprimersi dellinformazione genetica DNA (linguaggio chimico=nucleotidi) TRASCRIZIONE RNA (linguaggio chimico=nucleotidi) TRADUZIONE PROTEINE (linguaggio chimico=aminoacidi) PROCARIOTIEUCARIOTI TRASCRIZIONE (citoplasma) (nucleo) (RNA) TRADUZIONE (citoplasma)(citoplasma) (PROTEINE)

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10 TRASCRIZIONE Il DNA funziona da stampo per la sintesi di molecole di RNA. In questo modo linformazione genetica diventa direttamente utilizzabile per la cellula

11 Confronto DNA/RNA: RNA = 1 solo filamento (con strutture secondarie) zucchero RIBOSO anzichè desossi-riboso basi: A, C, G, e U (uracile) al posto di T Tipi di RNA mRNA (messaggero): porta l'informazione precisa di come sarà costituita la proteina cioè la sequenza degli aminoacidi tRNA (trasporto): i diversi tRNA trasportano i diversi amminoacidi (specificità tra tRNA e aminoacidi) rRNA (ribosomiale): insieme alle proteine ribosomiali costituiscono i RIBOSOMI officina funzionale dove vengono sintetizzate le proteine.

12 La trascrizione è una reazione di polimerizzazione per mezzo della quale vengono sintetizzati RNA. Gli RNA vengono sintetizzati copiando un singolo filamento di DNA (detto filamento di stampo) secondo la legge della complementarietà (con unica eccezione che A è complementare ad U). Il filamento non codificante viene chiamato filamento di senso. Quindi il filamento di RNA sarà complementare al filamento di stampo e uguale al filamento di senso. Per semplicità il gene viene indicato come il filamento di senso. La sintesi avviene in direzione 5' 3'. 5 CCGGAAGGCT 3' filamento di senso 3 GGCCTTCCGA 5' filamento di stampo (codificante) 5CCGGAAGGCU 3' RNA L'enzima che sintetizza RNA è la RNA-POLIMERASI capace di iniziare la sintesi dal primo nucleotide (che rimane trifosfato al 5'). La RNA-polimerasi non necessita quindi dell'innesco (primer).Vengono utilizzati nucleotidi trifosfati per fornire energia (ATP, UTP, CTP, GTP).

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14 1 sola RNA-polimerasi per mRNA, tRNA e rRNA (23S, 16S, 5S) *. L'RNA-polimerasi è composta dal core (subunità 2,, ') più la subunità sigma ( ). La polimerasi deve trascrivere una determinata sequenza di DNA corrispondente ad un gene. A monte della zona che dovrà essere trascritta esiste una zona di regolazione per il preciso e corretto attacco dell'RNA polimerasi. Tale zona di regolazione è detta PROMOTORE. I nucleotidi trascritti a partire dal sito di inizio di trascrizione vengono numerati con numeri positivi (+1, +2, +3,…). I nucleotidi del promotore a partire dal sito di inizio di trascrizione vengono numerati con numeri negativi (-1, -2, -3,…). * I ribosomiali si misurano in unità Svenberg che misurano la massa poiché non è possibile determinare l'alto numero di nucleotidi. Sono molto grandi e presentano una struttura secondaria PROCARIOTI

15 1) INIZIO DI TRASCRIZIONE La subunità sigma si lega al core ed esplora il DNA sino a trovare una sequenza a -35 dal sito di inizio della trascrizione e successivamente una sequenza a -10 dal sito di inizio della trascrizione ricca in T ed A detta PRIBNOWBOX alla quale si lega. Una volta legata induce il DNA a srotolarsi aprendo una bolla di trascrizione e posizionando il core in modo preciso perché copi il primo nucleotide (+1) e successivamente gli altri. Dopo aver iniziato la trascrizione sigma si stacca e va a legarsi ad un altro core. Il legame tra i vari nucleotidi viene formato dalla subunità mentre serve a tenere legato il DNA. 2) ALLUNGAMENTO La trascrizione procede in direzione 5' 3' secondo la legge della complementarietà formando legami fosfodiesterici fra i vari nucleotidi.

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17 3) TERMINAZIONE presenza di sequenze di terminazione (palindromiche) sul DNA: sequenze complementari invertite distanziate da un tratto centrale variabile. Es. -AGCCCGAACCGGACGGGCU- Queste sequenze una volta trascritte formano una struttura a stelo (più o meno complessa) che sgancia l'RNA trascritto dal legame con la RNA polimerasi e con il DNA.

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19 Il processo di trascrizione ha le stesse modalità descritte in Procarioti con alcune differenze: a) il DNA è complessato con proteine istoniche che devono essere temporaneamente allontanate per permettere la trascrizione; b) la trascrizione avviene nel nucleo; c) Esistono 3 tipi di RNA-polimerasi: RNA-polimerasi I per rRNA 28S, 18S, 5,8S (nel nucleolo) RNA-polimerasi II per mRNA (nel nucleo) RNA-polimerasi III per tRNA e rRNA 5S (nel nucleo) d) è richiesta la presenza di Fattori Trascrizionali Generali perché le RNA- polimerasi possano iniziare la trascrizione, in quanto non esiste il corrispondente del fattore sigma; e) gli RNA trascritti (PRIMARI) debbono subire delle trasformazioni (MATURAZIONE) prima di passare nel citoplasma ed essere funzionali. f) trascrizione e traduzione non sono contemporanee EUCARIOTI

20 RNA-POLIMERASI I Si trova nel nucleolo 1) Il DNA contenente i geni per gli rRNA si trova nel nucleolo. 2) La polimerasi I ha bisogno di 2 fattori trascrizionali generali (B ed S) per poter iniziare la trascrizione che si legano al promotore (da -100 a +20). 3) Trascrive nel nucleolo un filamento precursore 45S da cui vengono poi ritagliati i tre rRNA: 28S, 18S, 5,8S. 4) Le proteine ribosomiali vengono prodotte nel citoplasma e successivamente rientrano nel nucleo e quindi nel nucleolo dove si assemblano con i rispettivi rRNA per dare le due subunità ribosomiali. Promotori e fattori trascrizionali geni rRNA B S

21 Promotori e fattori trascrizionali geni tRNA e 5S rRNA RNA-POLIMERASI III Si trova nel nucleo. 1)Trascrive i diversi tRNA e l' rRNA 5S (unico ribosomiale non prodotto nel nucleolo dove poi migrerà). Trascrive alcuni snRNA. 2) La polimerasi III ha bisogno di fattori di trascrizione generali per iniziare (A,B,C per rRNA 5S e B,C per i tRNA). 3)Le zone regolatrici di attacco dei fattori trascrizionali e RNA- polimerasi non sono a monte del trascritto ma a valle: Promotori Interni. C B C B A

22 RNA-POLIMERASI II Si trova nel nucleo. Trascrive RNA primari (hnRNA) che verranno modificati (maturazione) per dare mRNA funzionanti. Trascrive alcuni snRNA interessati nella maturazione -Per iniziare ha bisogno di fattori trascrizionali generali (D, B, F, E, H). -Tali fattori si legano ad una sequenza del promotore detta TATA BOX (-40). -Esistono anche a monte della TATA BOX sequenze ricche di CG e CAAT BOX +1 site Initiation of transcription 30 TATA Box 80 CAAT Box GCGC Promotore basale per mRNA INIZIO La RNA Polimerasi II possiede una coda (CTD) che trasporta e fosforila i fattori necessari per i processi di maturazione

23 I NucleolorRNA 28S, 18S, 5.8S II NucleohnRNA (RNA immaturi) mRNA alcuni snRNA (piccoli RNA nucleari) III Nucleo tRNA rRNA 5S alcuni snRNA RNA polimerasi I, II, III RNA polimerasi Localizzazione Prodotti Sia in PROCARIOTI che in EUCARIOTI molte polimerasi si legano in sequenza al DNA per cui molti filamenti di RNA vengono trascritti dallo stesso gene in breve tempo

24 MATURAZIONE del trascritto primario (hnRNA) Durante lallungamento e la terminazione iniziano i processi di maturazione che porteranno allmRNA 1) Al 5' viene aggiunto un nucleotide (7-metilguanosina) detto Cappuccio con funzione di protezione dalla degradazione e funzione specifica nella traduzione. 2) Una polimerasi specifica aggiunge al 3' una lunga catena: ( ) nucleotidi di A (poli A) con funzione di protezione dalla degradazione. 3) L'hnRNA è costituito da sequenze dette esoni (codificanti) e sequenze dette introni (non codificanti). Grazie ad un complesso (spiliceosoma) che prevede l'intervento di ribonucleoproteine, piccoli e grandi RNA gli introni vengono escissi e gli esoni vengono saldati tra loro.

25 TERMINAZIONE e Poliadenilazione Aggiunta del cappuccio Poliadenilazione ALLUNGAMENTO e aggiunta del Capuccio

26 Rimozione degli introni e saldatura degli esoni (All'estremità 5' e 3' esistono sequenze specifiche e una A a circa 3/4 dellintrone che sono punti di riconoscimento per l'escissione delle sequenze introniche). Avviene dapprima un taglio al 5 e la formazione di un laccio tra il 5 e la A Successivamente avviene un taglio al 3 e i due esoni vengono uniti N° degli Esoni = N° degli Introni -1. Es. 6 esoni e 5 introni: --esone-introne-esone-introne-esone--


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