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0 1 Tabella 19.1 Esempi di enzimi di restrizione con indicazioni relative allorganismo di origine e alla sequenza di riconoscimento (la linea nera indica.

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2 1 Tabella 19.1 Esempi di enzimi di restrizione con indicazioni relative allorganismo di origine e alla sequenza di riconoscimento (la linea nera indica lasse di simmetria binaria mentre le frecce contraddistinguono i siti di taglio) TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

3 2 Figura 19.1 Meccanismo di azione di EcoRI (endonucleasi sticky end) (A) e Smal (enzima blunt end) (B). A B 19.1 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

4 3 Figura 19.2 Produzione di molecole di DNA ricombinante TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

5 4 Figura 19.3 Mappa di un plasmide modello usato come vettore di clonaggio composto di: sequenza di origine della replicazione (ori), gene per la resistenza allampicillina (ampR), gene per la β-galattosidasi (lacZ+) e regione con siti unici di restrizione (polylinker) VETTORI DI CLONAGGIO PLASMIDI

6 5 Figura 19.4 Saggio colorimetrico per il riconoscimento delle colonie batteriche ottenute da cellule contenenti il plasmide con linserto di DNA esogeno. PLASMIDI 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

7 6 Figura 19.5 Mappa di un plasmide usato per trascrivere RNA e per clonare DNA dei prodotti di PCR. PLASMIDI 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

8 7 Figura 19.6 Vettore di clonaggio derivato dal batteriofago λ. VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

9 8 Figura 19.7 Clonaggio di DNA esogeno in vettori di inserzione e di sostituzione. VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

10 9 Figura 19.8 Vettore di clonaggio cosmidico. VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

11 10 Figura 19.9 Vettore di clonaggio YAC circolarizzato unendo i telomeri con una regione di riempimento e linearizzato dopo restrizione con BamHI al fine di rimuovere la regione di riempimento: i siti unici di restrizione del polylinker possono essere impiegati per inserire frammenti di DNA esogeno. CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI BATTERI (BAC) 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

12 11 Figura Colonie di lievito contenenti vettori di clonaggio ricombinanti (bianche) e senza inserto di DNA esogeno (rosse). CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI BATTERI (BAC) 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

13 12 Figura Organizzazione di un vettore BAC. CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI BATTERI (BAC) 19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

14 13 Figura Costruzione di una libreria genomica GENOTECHE: LIBRERIE DI DNA GENOMICO (gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)

15 14 Figura Digestione totale e parziale di DNA genomico GENOTECHE: LIBRERIE DI DNA GENOMICO (gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)

16 15 Figura Sintesi di DNA complementare (cDNA) a doppia elica GENOTECHE: LIBRERIE DI DNA GENOMICO (gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)

17 16 Figura Clonaggio di cDNA in vettori plasmidici (A) e vettori derivati dal batteriofago λ (B) GENOTECHE: LIBRERIE DI DNA GENOMICO (gDNA) E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)

18 17 Figura Screening di una libreria plasmidica IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

19 18 Figura (A) Rappresentazione schematica di una membrana BAC. (B) Elenco ordinato delle piastre contenute in ogni campo IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

20 19 Figura Film autoradiografico ottenuto ibridando una membrana di una libreria BAC con una sonda RFLP (le frecce indicano i possibili cloni BAC contenenti lallele marcatore) IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

21 20 Tabella 19.2 Copertura genomica di librerie BAC di A. thaliana e di alcune delle principali specie di interesse agrario. GENOME COVERAGE DI UNA LIBRERIA 19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

22 21 Tabella 19.3 Numero (N) teorico di cloni richiesti per avere una probabilità pari al 99% che un determinato clone sia rappresentato nella libreri considerando inserti di 40 kb (cosmidi), 150 kb (BAC) e 500 kb (YAC) di lunghezza e con riferimento a diverse specie di interesse agrario. GENOME COVERAGE DI UNA LIBRERIA 19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

23 22 Figura Screening di una libreria fagica per la ricerca di uno specifico clone IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

24 23 Figura Risultato di una analisi autoradiografica di un filtro ibridato con uno specifico anticorpo marcato per lidentificazione di colonie di una libreria esprimenti una determinata proteina IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

25 24 Figura Metodo di sequenziamento a terminazione di catena ideato da Sanger, chiamato anche metodo dideossi SEQUENZIAMENTO DEI GENI

26 25 Figura Diversi tipi approccio per il sequenziamento con primer universali (disegnati sulle braccia del vettore) e primer interni (disegnati sullinserto clonato nel vettore) SEQUENZIAMENTO DEI GENI

27 26 Figura Lastra autoradiografica di una sequenza nucleotidica ottenuta con sistema manuale seguendo il metodo dideossi SEQUENZIAMENTO DEI GENI

28 27 Figura Sequenziamento automatico SEQUENZIAMENTO DEI GENI

29 28 Figura Sequenziamento dei cromosomi in ordine gerarchico (A) e col metodo shotgun (B) SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI A B

30 29 Figura Confronto tra vettori virali e plasmidici riguardo alle loro modalità di espressione PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI

31 30 Figura Elementi costitutivi essenziali di un genoma virale e vettore modello per lespressione transiente di un gene esogeno in pianta. METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

32 31 Figura Dischi fogliari con accentuata emissione di radici avventizie (hairy roots) in seguito ad infezione con A. rhizogenes. METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

33 32 Figura Rappresentazione schematica di un plasmide Ti con i principali elementi costitutivi. METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

34 33 Tabella 19.4 Elenco di sistemi di geni marcatori selezionabili e di geni reporter usati per la trasformazione genetica delle piante. METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

35 34 Figura Vettore di clonaggio derivante dalla ricombinazione omologa di un vettore cointegrato con uno intermedio. METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

36 35 Figura Rappresentazione schematica di un vettore binario e di un plasmide helper in agrobatterio. METODI DI TRASFERIMENTO GENICO MEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

37 36 Figura Metodo di trasformazione genetica mediato dal plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens; metodo biolistico di trasformazione genetica basata sullimpiego del particle gun (Adattato da: C.S. Gasser e R.T. Fraley (1992) Transgenic Crops, Scientific American Inc.). METODI CHIMICO-FISICI DI TRASFERIMENTO GENICO 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

38 37 Figura Vettori plasmidici impiegati per la trasformazione del genoma di cloroplasto: vettore contenente sia il gene esogeno che il gene marcatore selezionabile (A); vettori distinti contenenti il gene esogeno oppure il gene marcatore selezionabile (B). In entrambi i casi le sequenze geniche sono fiancheggiate da una regione di DNA del cloroplasto. INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

39 38 Figura Proteina fluorescente verde o GFP (green fluorescent protein): modello tridimensionale della proteina (A) e localizzazione subcellulare della proteina (B). INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI A B 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

40 39 Figura Sezione di tessuto fogliare con cellule competenti, non competenti e potenzialmente competenti alla rigenerazione e/o alla trasformazione. INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

41 40 Figura Segregazione 3:1 di un ipotetico marcatore PCR-derivato osservata nella discendenza T 1 ottenuta autofecondando una pianta T 0 avente una singola copia del transgene. INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

42 41 Figura Biosintesi delle antocianine (Fonte: B.R. Glick e J.J. Pasternak (1988) Molecular biotechnology. Principles and applications of recombinant DNA. American Society for Microbiology). INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

43 42 Figura Schema semplificato del processo di infezione da parte di Agrobacterium tumefaciens e di integrazione del T-DNA nel cromosoma della pianta ospite. Immagine al microscopio elettronico di agrobatteri e particolare di tumore del colletto (crown gall) nella vite. INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

44 43 Figura Statistiche relative alle piante geneticamente modificate. DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE TRANSGENICHE 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

45 44 Tabella 19.5 Lista delle principali PGM di I generazione autorizzate allimmissione sul mercato nei Paesi extra UE. DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE TRANSGENICHE 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

46 45 Tabella 19.6 Lista delle principali PGM di II generazione oggetto di sperimentazione in pieno campo. DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE TRANSGENICHE 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

47 46 Figura (A) Percorso biosintetico semplificato degli amminoacidi derivanti dallacido aspartico (la retroinibizione o inibizione a feedback è evidenziata in rosso); (B) vettore plasmidico usato per la trasformazione di soia e colza allo scopo di modificare il tenore di lisina nei semi (Pv5 e Pv3: promotore e terminatore del gene della β-faseolina di fagiolo; cts: regione codificante il peptide di transito del cloroplasto; dapA: gene di Corynebacterium codificante una acido diidropicolinico-sintasi (DHDPS) insensibile alla lisina; lysCM4: membro mutante di un gene di E. coli codificante una aspartato- chinasi (AK) insensibile alla lisina. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Miglioramento delle caratteristiche nutrizionali 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

48 47 Figura Produzione di β-carotene nel riso transgenico. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Miglioramento delle caratteristiche nutrizionali 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

49 48 Figura Chicchi di riso dorato, Golden rice. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Miglioramento delle caratteristiche nutrizionali 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

50 49 Tabella 19.7 Alcuni esempi di erbicidi con diversa modalità di azione e di enzimi codificati da geni clonati per lo più nei procarioti ed impiegati per produrre piante transgeniche resistenti agli erbicidi. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze agli erbicidi 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

51 50 Figura Mappa del T-DNA di un costrutto chimerico. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

52 51 Figura Batteri di Bacillus thuringiensis (A) ed esempi di piante transgeniche resistenti agli insetti: danni da piralide in spighe e culmi di mais (B, C): varietà di mais Bt (D); foglie di una varietà di soia Bt e di una normale (E,F); capsule di una varietà di cotone Bt e di una normale (G,H). APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze a stress biotici (patogeni) 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

53 52 Figura Mortalità delle larve del coleottero Callosobruchus maculatus sulle piante di pisello transgenico in relazione alla quantità di inibitore dellα-amilasi. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze a stress biotici (patogeni) 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

54 53 Figura (A) Strategia antisenso: la trasformazione di piante con geni aventi un orientamento inverso rispetto alle regioni di regolazione determina il blocco della espressione del corrispondente gene endogeno. (B) Pomodori transgenici e prodotto commerciale americano a base di pomodori transgenici. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Resistenze a stress biotici (patogeni) B A 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

55 54 Figura Ruolo degli essudati radicali (ER) nei suoli acidi e in quelli alcalini. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Tolleranza a stress abiotici (ambientali) 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

56 55 Figura Melanzana partenocarpica (foto: A. Spena). APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo dello sviluppo e del sistema riproduttivo 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

57 56 Figura Tecnologia gene terminator. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo dello sviluppo e del sistema riproduttivo 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

58 57 Figura Fiore wild-type (A) e del mutante partenocarpico di pomodoro pat-2 (B, notare laccrescimento precoce dellovario), Bacche wild-type (C) e del mutante pat-2 (D, notare lassenza di seme) (foto: P. Mosconi). APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo dello sviluppo e del sistema riproduttivo 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

59 58 Tabella 19.8 Esempi di partenocarpia naturale, artificiale e biotecnologia scoperta o ottenuta in diverse specie di interesse agrario. APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE Controllo dello sviluppo e del sistema riproduttivo 19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM): METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

60 59 Figura RNA interference: meccanismo di azione TRASFORMAZIONE GENETICA COME STRUMENTO PER LO STUDIO DELLA FUNZIONE GENICA: RNA INTERFERENCE (RNAi) E SILENZIAMENTO GENICO POST-TRASCRIZIONALE

61 60 Figura Struttura della molecola di un anticorpo PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

62 61 Tabella 19.9 Espressione di anticorpi in piante transgeniche. PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

63 62 Figura Costi per grammo di immunoglobulina A prodotta con diversi sistemi di espressione. PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

64 63 Tabella Piante transgeniche che producono proteine potenzialmente utilizzabili come vaccini. PRODUZIONE DI VACCINI (PROTEINE IMMUNOGENE) EDULI NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

65 64 Tabella Produzione di composti biofarmaceutici con piante transgeniche per la terapia medica nelluomo. PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI PROTEINE UMANE NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

66 65 Figura Rappresentazione schematica della GAD65 umana: sono evidenziati il segnale di ancoraggio alle membrane, il sito cataliticoe gli epitopi immunoreattivi della proteina. PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI PROTEINE UMANE NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

67 66 Figura Immagine al microscopio elettronico del tessuto fogliare di piante transgeniche di tabacco che evidenzia la localizzazione subcellulare della hGAD65 a livello di cloroplasti e mitocondri. La immuno-marcatura in situ è stata condotta utilizzando anticorpi specifici per la hGAD65. PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI PROTEINE UMANE NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

68 67 Figura Localizzazione sub-cellulare della GAD67/65: la fotografia, ottenuta tramite microscopia elettronica del tessuto fogliare di piante transgeniche di tabacco dopo immuno-marcatura con anticorpi specifici per la GAD67/65, mostra segnali a livello citosolico. PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICI E DI PROTEINE UMANE NELLE PIANTE 19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE


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