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STUDIO DI TRANSGENI E GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO PRESENTI IN ALIMENTI E MANGIMI A BASE DI SOIA E MAIS MEDIANTE DIGITAL PCR RELATORE INTERNO Prof.ssa.

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1 STUDIO DI TRANSGENI E GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO PRESENTI IN ALIMENTI E MANGIMI A BASE DI SOIA E MAIS MEDIANTE DIGITAL PCR RELATORE INTERNO Prof.ssa Giovanna Serino RELATORE ESTERNO Dott.ssa Marzia De Giacomo CANDIDATO Piero Onorati Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Genomiche Industriali ed Ambientali

2 Sviluppo delle colture GM dal 1996 al 2014 DIFFUSIONE DELLE COLTURE OGM A LIVELLO GLOBALE

3 NORMATIVA COMUNITARIA E NAZIONALE SULLA COMMERCIALIZZAZIONE DEGLI OGM NEL SETTORE ALIMENTARE Direttiva CE n. 18/2001 Regolamentazione sull’emissione nell’ambiente di OGM Regolamento CE n. 1829/2003 Autorizzazione di nuovi OGM e di alimenti e mangimi contenenti OGM Obbligo di etichettatura per alimenti e mangimi contenenti OGM (soglia 0,9%) Regolamento CE n. 1830/2003 Tracciabilità ed etichettatura di OGM e di alimenti e mangimi ottenuti da OGM AutorizzazioneUtilizzo

4 Molecole target: DNA (template) o proteine Sistemi diagnostici: Per il DNA: primers e sonde Per le proteine: anticorpi Materiali di riferimento: Controlli positivi e negativi Calibranti per la quantificazione METODI DI ANALISI PER GLI OGM Analita

5 METODI DI ANALISI PER GLI OGM Metodi basati sulla sequenza nucleotidica Monitoraggio in tempo reale dell’andamento della PCR Ct proporzionale alla quantità iniziale di DNA target Quantificazione relativa transgene endogeno % OGM = Uso di sonde di ibridizzazione (TaqMan) legate a molecole fluorescenti (reporter e quencher)

6 GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO TAXON SPECIFICI Necessità della selezione di un gene endogeno di riferimento adatto alla quantifica di OGM Superamento dei punti critici della real-time PCR nella quanitfica di OGM -gestione elevato numero di CRM per rette di taratura e mancanza di CRM per eventi non autorizzati -inibitori della PCR in matrici complesse -analisi quantitative condizionate dall’efficienza di amplificazione Vantaggi nell’uso della digital PCR -analisi quantitative assolute delle copie genomiche senza rette di calibrazione -non influenzata da inibitori della PCR -analisi quantitative svincolate dall’efficienza di amplificazione Specie specifio – Una o poche copie nel genoma – Rappresentativo di differenti varietà della stessa specie – Stabile nel genoma

7 SCOPO DEL LAVORO Selezione di geni endogeni di riferimento affidabili, in termini di specificità e stabilità nel genoma, delle specie zea mays e glycine max (ricerca in letteratura) Valutazione del loro utilizzo in tecniche di digital PCR Ottimizzazione e validazione del metodo di analisi in digital PCR Confronto dei metodi di analisi di digital e real-time PCR Valutazione dell’applicabilità del metodo in digital PCR a campioni di mangimi ed alimenti altamente processati

8 GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO Papazova et. al., 2010 Gene endogeno selezionato per mais hmg presenza in singola copia nel genoma assenza di SNP nella sequenza sonda stabile nella replicazione di PCR sequenza conservata nel genoma Gene endogeno selezionato per soia Le1 presenza in singola copia nel genoma sequenza uniforme e stabile ampio utilizzo in metodi validati

9 METODI DI ANALISI PER GLI OGM digital PCR

10 OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR MaisSoia EndogenoTransgeneEndogenoTransgene Variazione del protocollo termico di replicazione Temperatura °C Numero di cicli termici Variazione della concentrazione di primers e sonda Concentrazione Primers nM Concentrazione Sonda nM Variazione della concentrazione di DNA campione Concentrazione ng/µl 0,2 - 10

11 n. CicliTemperatura °Cn. CicliTemperatura °C hmg MON Le GTS OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione del protocollo termico di replicazione Ogni prova è stata condotta in 5 replicati

12 OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione del protocollo termico di replicazione 60° C 41 cicli60° C 45 cicli hmg mais FAM / VIC = fluorofori per sonde di PCR TaqMan

13 OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione del protocollo termico di replicazione 60° C 45 cicli55° C 45 cicli Le1 soia FAM / VIC = fluorofori per sonde di PCR TaqMan

14 OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione della concentrazione di primers e sonda Concentrazione primers nM Concentrazione sonda nM Replicati sperimentali Gene endogeno hmg di mais Primers 300 nM Sonda 100 nM

15 OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione della concentrazione di DNA Materiale di riferimento certificato (CRM) di mais, gene endogeno hmg Materiale di riferimento certificato (CRM) di mais, transgene MON810 Concentrazione DNA ng/µl Lettura spettrofotometrica (copie genomiche/μl) Risultati medi digital PCR (copie genomiche/μl) Replicati sperimentali ± ± ± ± ± ± 515 Concentrazione DNA ng/µl Lettura spettrofotometrica (copie genomiche/μl) Risultati medi digital PCR (copie genomiche/μl) Replicati sperimentali ± ± ± ± ± 185

16 VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Punto di diluizione Concentrazione DNA (ng/μl) Diluizioni Numero replicati sperimentali C11,3 1 : 17 C20,65 1 : 27 C30, : 47 C40,065 1 : 2,57 C50, : 27 C60, : 57 Range dinamico Limite di quantificazione (LOQ)* Limite di rilevabilità (LOD)* Precisione Accuratezza Specificità* Applicabilità Praticabilità* CRM Mais MON810 5% m/m 2.98% cg/cg

17 VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Range dinamico y = 0,923x - 62,526 R² = 0,998 y = 0,824x + 3,279 R² = 0,999

18 VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Applicabilità su matrici complesse Soglia di accettazione ±25% del valore certificato Circuiti interlaboratorio per il controllo di qualità esterno dei metodi

19 hmg Concentrazione DNA (ng/μl) Fattore di diluizione Numero medio di copie genomiche Rapporto diluizioni misurato Deviazione standard relativa % Numero medio pozzetti accettati Numero medio pozzetti positivi 1, , , ,27, , ,03, ,0652,52972,57, , ,06, , ,621, MON810 Concentrazione DNA (ng/μl) Fattore di diluizione Numero medio di copie genomiche Rapporto diluizioni misurato Deviazione standard relativa % Numero medio pozzetti accettati Numero medio pozzetti positivi 1, , ,652882,014, , ,412, ,0652,5131,944, , ,757, , ,1103, VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR

20 Accuratezza C1C2 C4 C5 C6 Soglia di accettazione ±25% del valore certificato

21 CONFRONTO TRA dPCR E real-time PCR ParametrodPCRqPCR Range dinamico copie LOQ MON cgMON cg LOD MON810 6 cgMON cg Precisione (RSDr%) hmg < 25% MON810 < 25% hmg < 35% MON810 < 35% Accuratezza (Bias) Da -18% a 10%Da -6% a 2% Applicabilità - matrice % MON810 in accordo con i valori assegnati nei PT NA Praticabilità - tempo necessario all'ottenimento dei risultati per analisi 6 ore5 ore - prezzo per campione 31,34 €35 €

22 CONCLUSIONI I geni endogeni selezionati ed utilizzati in questo studio sono stati l’hmg codificante la proteina high mobility group per il mais ed il gene Le1 codificante la lectina per la soia. Questi sono stati utilizzati per condurre l’ottimizzazione e la validazione del metodo in digital PCR.  Elevate precisione ed accuratezza  Elevata sensibilità  Possibilità di applicazione su matrici complesse altamente processate  Costi e tempistiche di lavoro contenuti  Possibilità di trasferire facilmente metodi analitici già validati  Ottenere risultati di analisi per il controllo di OGM in numero assoluto di copie genomiche senza l’utilizzo di curve di calibrazione Il confronto tra le due tecniche di quantificazione ha mostrato come la digital PCR sia in grado di eguagliare ed in diversi casi di migliorare le prestazioni ottenibili in real-time PCR. I dati di questo studio sono stati ottenuti nell’ambito di un progetto di ricerca sull’applicazione della digital PCR nel controllo ufficiale degli OGM coordinato dall’IZS delle regioni Lazio e Toscana e presentati all’interno di un gruppo di lavoro coordinato dall’ENGL (European Network of GMO Laboratories)

23 PROSPETTIVE FUTURE Possibilità di effettuare analisi in duplex e multiplex così da abbattere i costi grazie ai sistemi di droplet digital PCR. Applicazione a metodi di screening quantitativi. Validazione del metodo per i campioni di soia in dPCR. Sviluppo del metodo multiplex multi-screening per 6 eventi specifici di soia in unica analisi (nell’ambito del progetto coordinato dall’IZSLT).

24 GRAZIE DELL’ATTENZIONE (Kary Mullis) Un grande grazie alla professoressa Giovanna Serino a Roberta Onori, Marzia De Giacomo, Carlo Brera e alle “grandi” a tutte le ragazze (ed i ragazzi, pochi, tre) del laboratorio OGM e Micotossine dell’ISS

25 Droplet digital PCR multipex

26

27 71 eventi autorizzati: 38 eventi singoli 33 eventi stacked Eventi stacked: nuovi prodotti con più di un evento di trasformazione Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in UE: eventi autorizzati

28 12 eventi soia (di cui 1 stacked) (+ 7 in corso di autorizzazione) 39 eventi mais (di cui 26 stacked) (+ 9 in corso di autorizzazione) 7 eventi colza (di cui 3 stacked) (+ 2 in corso di autorizzazione) 10 eventi cotone (di cui 3 stacked) (+ 1 in corso di autorizzazione) 1 evento barbabietola da zucchero 2 microorganismi GM Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in UE: eventi autorizzati


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