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Il lievito Saccharomyces cerevisiae Genetica inversa  Sistema modello d’eccellenza Pagina 22 Pagina 1  Gene disruption  Trasformazione per ricombinazione.

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Presentazione sul tema: "Il lievito Saccharomyces cerevisiae Genetica inversa  Sistema modello d’eccellenza Pagina 22 Pagina 1  Gene disruption  Trasformazione per ricombinazione."— Transcript della presentazione:

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2 Il lievito Saccharomyces cerevisiae Genetica inversa  Sistema modello d’eccellenza Pagina 22 Pagina 1  Gene disruption  Trasformazione per ricombinazione omologa Cassette geniche  Sequenza genomica nota  Facile manipolazione in laboratorio  Elevata conservazione evolutiva dei meccanismi cellulari fondamentali  Studio funzione geni non essenziali

3 Cse4: variante dell’istone centromerico H3 Pagina 23  Essenziale per successiva formazione cinetocore e corretta segregazione cromosomica  Incorporata in unico ottamero istonico nella regione centromerica CDEII Ubiquitinazione  Catene di poliubiquitina  Degradazione proteasomica  Elimina copie presenti in siti ectopici

4 Pagina 24 Cse4 istone variante centromerica H3 Psh1 E3 ubiquitina ligasi Ubp8 ubiquitina proteasi Doa1 ubiquitina ligasi Studio delle interazioni genetiche e funzionali Pagina 3  Pathway coinvolto nella regolazione della localizzazione centromerica di Cse4  Analisi fenotipica di ceppi deleti in geni non essenziali

5 Pagina 25 Background genetico dei ceppi  w303 wild type  cse4-1 temperatura sensibile  CSE4: gene essenziale 28°C 35°C  cse4-1,  psh1  cse4-1,  ubp8  cse4-1,  doa1  cse4-1,  psh1  ubp8  cse4-1,  doa1/  psh1  cse4-1,  doa1/  ubp8 Pagina 4  PSH1, UBP8, DOA1: geni non essenziali Disruption genica

6 Pagina 26 Disruption dei geni PSH1 e UBP8 nel doppio mutante cse4-1,  doa1  cse4-1,  doa1/  ubp8  cse4-1,  doa1/  psh1 Pagina 5 Analisi cassetta HIS-3 contenente sequenze di omologia per PSH1  Amplificazione della cassetta di trasformazione HIS-3

7 Pagina 27 Pagina 6 Identificazione dei ceppi trasformati +  Selezione di colonie istidina +  Colony PCR PSH1 HIS-3 K2 PSH1 UBP8 HIS-3 UBP8 K2 UBP8 ~ 350 bp

8 8 Pagina 7 Identificazione di interazioni geniche tra proteine mediante l’analisi di ceppi mutanti  Confronto tra singoli e doppi mutanti  Effetto migliorativo o peggiorativo

9 x b a Pagina 8 Recupero della crescitaLetalità sintetica  Interazione epistatica ab x  Interazione funzionale Effetto migliorativoEffetto peggiorativo

10 Pagina 210 Pagina 9 Saggio di crescita su piastra  Osservazione delle interazioni geniche e funzionali

11 Pagina 211 Pagina 10

12 Pagina 212 Pagina 11 Doa1 Psh1 Ubp8 Cse4 +Ub -Ub +Ub CONCLUSIONI  S. cerevisiae organismo modello  Genetica reversa  Ceppi t.s. cse4-1  Interazioni geniche e funzionali  Interazione funzionale di DOA1 e PSH1 con CSE4  Interazione epistatica tra PSH1 e UBP8 con CSE4 Recupero della crescita Letalità sintetica Esclusiva localizzazione centromerica della variante istonica Cse4 tramite proteolisi mediata da ubiquitina

13 Pagina 213 GRAZIE PER L’ATTENZIONE


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