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Non solo danni: l'ozono come strumento prezioso per lo studio delle risposte agli stress nelle piante R. Bernardi, M. Durante, L. Guidi, G. Lorenzini,

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Presentazione sul tema: "Non solo danni: l'ozono come strumento prezioso per lo studio delle risposte agli stress nelle piante R. Bernardi, M. Durante, L. Guidi, G. Lorenzini,"— Transcript della presentazione:

1 Non solo danni: l'ozono come strumento prezioso per lo studio delle risposte agli stress nelle piante R. Bernardi, M. Durante, L. Guidi, G. Lorenzini, C. Nali, S. Pasqualini, C. Pugliesi, A. Ranieri, A. Saviozzi, L. Sebastiani, M. Badiani Rete Informativa su Ozono e Vegetazione Ozono e vegetazione: il contributo della ricerca italiana 24 Novembre 2006 Centro Interdipartimentale Ricerche Agro-Ambientali "Enrico Avanzi" San Piero a Grado, Pisa

2 La Bel-W3 e la Bel-B di tabacco

3 (da Lorenzini, 1999)

4 Perché non solo danni? Perché il danno visibile non è sempre correlato alleffetto biologico globale Perché danno visibile ed effetti subliminali (sensu Lorenzini) mostrano spesso percorsi molecolari distinti Perché lozono evoca risposte di difesa comuni anche ad altri fattori di stress, biotici ed abiotici

5 (da Buchanan, Gruissem e Jones, 2001)

6 (Zhang e Klessig, TIPS, 6, , 2001)

7 Risposte molecolari di difesa dallozono Fitoalessine & fenilpropanoidi Barriere fisiche (lignina, estensine, callosio) Proteine PR Ormoni & molecole segnale (ET, SA, JA) Sistemi antiossidanti Flussi di Ca Morte cellulare programmata (HR/PCD)

8 Lozono come strumento preciso, riproducibile, potente ma finemente modulabile da impiegare come elicitore abiotico di risposte di difesa MIUR-PRIN 1998, 2000, 2002, 2003, 2005 UniPG UniPI SSSUP UniMRC S. Pasqualini & Coll. L. Guidi A. Ranieri A. Saviozzi + Coll. L. Sebastiani & Coll. R. Bernardi M. Durante C. Pugliesi + Coll.

9 UR-UniMRC, PRIN 2003 & 2005 Uso di linee di pomodoro mutanti o transgeniche per uno o più componenti coinvolti nei networks di elicitazione e difesa UniPI – G. Lorenzini & Coll Trattamenti & patologia UniTuscia – G.P. Soressi, M. Ciaffi & Coll Materiale vegetale Supervisione bioinformatica & genetica UniPG– S. Pasqualini & Coll Ormoni (SA, JA) SSSUP – L. Sebastiani & Coll ROS (H 2 O 2 ) & NOS (NO) UniMRC – M. Badiani & Coll ET, antiox, espressione genica, ROS (. O 2 - ), morte cellulare (Evans Blue), HCN

10 PRIN-MIUR Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle piante allozono e ad altri stress abiotici Obbiettivi: caratterizzare le risposte allo stress da ozono e/o altri stress; seguire linduzione di stress ossidativo extra- ed intracellulare; determinarne gli effetti specifici nei vari compartimenti cellulari; caratterizzare i trasduttori di segnali; studiare lespressione di geni coinvolti nelle risposte ai vari livelli. Cofinanziamento totale Euro

11 Pathway di trasduzione del segnale nella risposta delle piante all'ozono: ruolo dell'acido jasmonico e del processo di morte celulare programmata Meccanismi molecolari di induzione genica coinvolti nella risposta delle piante all'ozono (Bernardi-Durante-Pugliesi) Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle piante allozono e ad altri stress abiotici: aspetti fisiologici e biochimici (Guidi-Ranieri) Il ruolo dei secondi messaggeri nei meccanismi di trasduzione dello stress da ozono in specie dinteresse agrario Ruolo di H 2 O 2, etilene e cistein-proteasi nella risposta allozono ed a stress da alta temperatura in pomodoro PRIN-MIUR

12 PRIN-MIUR L'ozono come strumento per lo studio dello stress biotico ed abiotico nelle piante: analogie e divergenze nelle risposte di compensazione e difesa, inducibilità crociata e protezione crociata Obbiettivi: caratterizzare e monitorare degli effetti mediati dal suolo ed interazioni pianta/suolo in presenza di stress combinato da ozono e metalli pesanti; analogie e differenze nei meccanismi di risposta allo stress da ozono e/o da metalli pesanti ; analogie e differenze nei meccanismi di risposta allo stress da ozono e/o da elevata irradianza, elevata temperatura o sostanze chimiche ; ruolo di recettori di membrana, proteina chinasi e fattori di trascrizione ed interazioni tra molecole segnale nella percezione e trasduzione dello stimolo e nell'orchestrazione di risposte di difesa in condizioni di stress da ozono e/o infezione da patogeno.

13 Cofinanziamento totale Euro PRIN-MIUR

14 La risposta delle piante allo stress da ozono e da patogeno: percezione e pathway di trasduzione del segnale Meccanismi molecolari coinvolti nell'attivazione di geni differenzialmente espressi in seguito a stress da ozono in ibridi di pioppo sensibili e tolleranti (Bernardi-Durante-Pugliesi). Ozono e metalli pesanti: analogie e differenze tra le risposte del sistema suolo-pianta ai due fattori di stress (Guidi-Ranieri-Saviozzi) Il ruolo del glutatione e del perossido di idrogeno nella risposta delle piante allo stress da ozono e metalli pesanti: sistemi di difesa antiossidativi e fitochelatine Interazioni nell'induzione di risposte di difesa all'ozono e ad agenti fisici e chimici di stress in mutanti di pomodoro per la sintesi di pigmenti fotosintetici e/o fotoprotettivi o per l'espressione di geni coinvolti nel meccanismo di PCD PRIN-MIUR

15 Specie vegetali SpecieAccessioni S. lycopersicum (pomodoro)linee differenzialmente suscettibili a virus o tracheomicosi; mutanti per la percezione/biosintesi di etilene; mutanti lesion mimic; mutanti per il colore; transgeni (resistenza al patogeno/ PCD) Ph. vulgaris (fagiolo)cultivar differenzialmente suscettibili H. annuum (girasole)cultivar differenzialmente suscettibili N. tabacum (tabacco)Bel-W3/Bel-B L. albus (lupino) A. thalianaecotipo Col-0 e linee mutanti loss of function P. deltoides x P. maximowiczii - P. x euramericana (pioppo) cloni differenzialmente suscettibili

16 Trattamenti con ozono acuto: 100 – 300 ppb per ore cronico ppb per giorni Combinazione di stress metalli pesanti alta irradianza ipertermia infezione da batteri o funghi fitopatogeni

17 Effetti & funzioni Danno visibileFitochelatine AccrescimentoProteine correlate alla patogenesi Assorbimento ed utilizzazione dellenergia luminosa: assimilazione netta di CO 2 pigmenti (fotosintetici, fotoprotettivi, antiossidanti e dissipazione dellenergia fluorescenza della clorofilla a in vivo carbossilasi primarie e ciclo di Calvin Metabolismo secondario (fenilpropanoidi, antocianine) ROS (perossido didrogeno, superossido, ossido nitrico) quali pro-ossidanti (burst ossidativo) o messaggeri Ormoni (ET, JA, SA) e loro metabolismo (metodi originali di dosaggio ad hoc; approccio farmacologico) Geni ed enzimi ROS-generantiRecettori e cascate di segnalazione (MAPK) Geni ed enzimi ROS-scavengingEspressione genica e regolazione della trascrizione (isolamento ed analisi del promotore e fattori di trascrizione) Antiossidanti e loro metabolismoSenescenza Geni della biosintesi di antiossidantiMorte cellulare/HR/PCD (differenziazione / lancio ed esecuzione / contenimento)

18 Attrezzature, strumentazione & tecniche Fumigazione in ambiente controllatoScambi gassosi mediante IRGA Microscopia ottica ed elettronicaMicroestrazione in fase solida Analisi dimmagineCromatografia liquida ed in fase gassosa interfacciate a spettrometria di massa Analisi chimica e biochimica del suoloEnzimologia Frazionamento cellulare e purificazione di organuli Immunoquantificazione di proteine (analisi Western) Infiltrazione sottovuoto di tessutiEstrazione e purificazione di acidi nucleici Spettroscopia UV/VIS e di fluorescenzaStudio espressione genica [analisi Northern, RT- PCR, cDNA-AFLP, ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH), analisi globale del trascrittoma (arraying), studio dei patterns di espressione, ibridazione in situ ] Spettroscopia atomicaMetodologie bioinformatiche & biostatistiche (disegno di primers, esplorazione di banche dati, espressione genica comparata) Analisi della dinamica stomaticaTecniche di ibridazione e trasformazione genica

19 Pubblicazioni PRIN-MIUR /

20

21 Analysis of gene expression induced by chronic ozone exposure in the Mediterranean shrub Phillyrea latifolia L. by cDNA-AFLP A.R. Paolacci, C. Miraldi, O. A. Tanzarella, M. Badiani, E. Porceddu, C. Nali, G. Lorenzini and M. Ciaffi (submitted)

22 Progetto FIRB-PlantSTRESS Caratterizzazione genetica e molecolare della risposta allo stress da ozono in frumento (Marabottini et al., 2005)

23 Progetto FIRB-PlantSTRESS Caratterizzazione genetica e molecolare della risposta allo stress da ozono in frumento Tab. 1 – Homologies with sequences in the databases of wheat cDNA sequences preferentially expressed in ozonated plants. ClonebpExpressionHomologyBLASTSpeciesHomologous proteinFunction pattern(Acc. N.)score ODI-54724AL A. thaliana Putative phosphatidate cytidyltransferaseSignal transduction ODI AY L. esculentum MAP kinaseSignal transduction ODI U T. aestivum CalmodulinSignal transduction ODI AJ O. sativa Phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase (PIPK1)Signal transduction ODI Q8GXJ4332 A. thaliana Glutamate-receptorSignal transduction OPI-15974AP O. sativa Inositol-1-monophosphataseSignal transduction OPI AF T. aestivum LRR Receptor-like kinaseSignal transduction ODI-73786AP O. sativa EH an EF proteinInvolved in endocytosis and signal transduction ODI-47223AJ T. aestivum Glutathione S-transferaseCell rescue-defence ODI AJ T. aestivum Glutathione synthetaseCell rescue-defence ODI AJ O. sativa Gamma-glutamyl-cysteine synthetaseCell rescue-defence OPI AF T. aestivum Chloroplastic ascorbate-peroxidaseCell rescue-defence OPI AJ H. vulgare Cytosolic ascorbate peroxidaseCell rescue-defence OPI AJ T. aestivum Glutathione S-transferaseCell rescue-defence OPI P H. vulgare Carbonic anhydraseCell rescue-defence ODI AV T. aestivum Allene oxide synthaseJasmonate biosynthesis ODI AJ H. vulgare Allene oxide cyclaseJasmonate biosynthesis ODI-66626AP O. sativa ACC synthaseEthylene biosynthesis ODI AP O. sativa ACC oxidaseEthylene biosynthesis ODI-98324AJ C. sativus Carotenoid oxidaseABA biosynthesis OPI AY O. sativaRnase L inhibitor-like proteinTranscription OPI AC A. thaliana MYB proteinTranscription ODI BX O. sativa Putative subtilaseProtein degradation OPI-25972AF A. thaliana Putative ABC transporterCellular organization ODI-15614AP O. sativa UnknownUnknown ODI-37641AC C. elegans UnknownUnknown OPI-94132AC O. sativa UnknownUnknown OPI AY R. erithropolis UnknownUnknown ODI AE O. sativa Unknown Unknown Tab. 1 – Homologies with sequences in the databases of wheat cDNA sequences preferentially expressed in ozonated plants. ClonebpExpressionHomologyBLASTSpeciesHomologous proteinFunction pattern(Acc. N.)score ODI-54724AL A. thaliana Putative phosphatidate cytidyltransferaseSignal transduction ODI AY L. esculentum MAP kinaseSignal transduction ODI U T. aestivum CalmodulinSignal transduction ODI AJ O. sativa Phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase (PIPK1)Signal transduction ODI Q8GXJ4332 A. thaliana Glutamate-receptorSignal transduction OPI-15974AP O. sativa Inositol-1-monophosphataseSignal transduction OPI AF T. aestivum LRR Receptor-like kinaseSignal transduction ODI-73786AP O. sativa EH an EF proteinInvolved in endocytosis and signal transduction ODI-47223AJ T. aestivum Glutathione S-transferaseCell rescue-defence ODI AJ T. aestivum Glutathione synthetaseCell rescue-defence ODI AJ O. sativa Gamma-glutamyl-cysteine synthetaseCell rescue-defence OPI AF T. aestivum Chloroplastic ascorbate-peroxidaseCell rescue-defence OPI AJ H. vulgare Cytosolic ascorbate peroxidaseCell rescue-defence OPI AJ T. aestivum Glutathione S-transferaseCell rescue-defence OPI P H. vulgare Carbonic anhydraseCell rescue-defence ODI AV T. aestivum Allene oxide synthaseJasmonate biosynthesis ODI AJ H. vulgare Allene oxide cyclaseJasmonate biosynthesis ODI-66626AP O. sativa ACC synthaseEthylene biosynthesis ODI AP O. sativa ACC oxidaseEthylene biosynthesis ODI-98324AJ C. sativus Carotenoid oxidaseABA biosynthesis OPI AY O. sativaRnase L inhibitor-like proteinTranscription OPI AC A. thaliana MYB proteinTranscription ODI BX O. sativa Putative subtilaseProtein degradation OPI-25972AF A. thaliana Putative ABC transporterCellular organization ODI-15614AP O. sativa UnknownUnknown ODI-37641AC C. elegans UnknownUnknown OPI-94132AC O. sativa UnknownUnknown OPI AY R. erithropolis UnknownUnknown ODI AE O. sativa Unknown Unknown (Paolacci et al., 2004)


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