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PEPTIDE SYNTHESIS PEPTIDE SYNTHESIS. Molecole di peso molecolare inferiore ai 5000 dalton, costituiti da una catena di pochi amminoacidi (fino a 100 circa),

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Presentazione sul tema: "PEPTIDE SYNTHESIS PEPTIDE SYNTHESIS. Molecole di peso molecolare inferiore ai 5000 dalton, costituiti da una catena di pochi amminoacidi (fino a 100 circa),"— Transcript della presentazione:

1 PEPTIDE SYNTHESIS PEPTIDE SYNTHESIS

2 Molecole di peso molecolare inferiore ai 5000 dalton, costituiti da una catena di pochi amminoacidi (fino a 100 circa), uniti tra di loro attraverso un legame peptidico (amidico). PEPTIDI

3 PEPTIDI Costituenti delle proteine Ormoni Neurotrasmettitori Antibiotici/Antibatterici Veleni Partecipano alla risposta immunitaria Sviluppo di patologie Farmaci Nanotecnologie

4 PEPTIDI Ormoni Insulina Glucagone

5 PEPTIDI Neurotrasmettitori Sintetizzati come pre-proteine del reticolo endoplasmatico rugoso dove viene rimossa la sequenza segnale. La pre-proteina risultante attraversa lapparato di Golgi e viene immagazzinata in vescicole. Allinterno delle vescicole si completa la formazione del peptide: scissione proteolitica, modificazione delle estremità del peptide, glicosilazione, fosforilazione, formazione dei ponti disolfuro.

6 PEPTIDI Antibatterici Proline-rich proteins Istatine Cistatine

7 PEPTIDIVeleni Conopeptidi

8 PEPTIDI Risposta immunitaria

9 Patologie legate ai peptidi: Alzheimer

10 PEPTIDI Farmaci

11 PEPTIDI Farmaci bassa stabilità metabolica scarso assorbimento dopo somministrazione orale scarso passaggio della barriera ematoencefalica PeptidePeptidomimetico

12 PEPTIDI Nanotecnologie

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16 1881 & 1902 Prima attivazione del gruppo carbossilico & Sintesi di un tripeptide Theodor Curtius ( )

17 1901 Prima sintesi chimica di un peptide NH 2 free Emil Fischer (1852–1919) 1902 Nobel Prize …la quantità di lavoro che cè da fare è talmente enorme che in confronto le scoperte sui carboidrati sembrano un gioco da ragazzi.

18 1932 Introduzione del gruppo benzilossicarbonilico (Cbz o Z) Max Bergmann ( ) & Leonidas Zervas ( )

19 1953 Sintesi dellOssitocina Vincent du Vigneaud ( ) 1955 Nobel Prize

20 1957 Introduzione del gruppo t-butossicarbonilico (Boc) George W. Anderson & Anne McGregor J. Am. Chem. Soc., 1957, 79,

21 1963 J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, L-A-G-V

22 BRUCE MERRIFIELD ( ) 1984 Nobel Prize

23 BRUCE MERRIFIELD la mia resa complessiva è stata del 7% e mi ci sono voluti 11 mesi. Sicuramente un chimico dei peptidi con più esperienza avrebbe fatto meglio, ma non senza uno sforzo considerevole VANTAGGI Work-up per semplice filtrazione Possibiltà di utilizzare i reattivi in grande eccesso Riduzione dei tempi di sintesi Automatizzazione del processo Legare covalentemente un aa ad un supporto insolubile e far crescere il peptide.

24 LE TRE GRANDI SFIDE Bruce contro i chimici!!! Passare dalla teoria alla pratica. Abbattere la resistenza dei chimici sintetici verso questo nuovo metodo (…non è assolutamente chimica, è un approccio che verrà soppresso dalla comunità). Far capire che anche un biochimico può avere le credenziali per proporre un cambiamento rivoluzionario nella sintesi chimica (Questo non è il modo di sintetizzare i peptidi).

25 L-A-G-V Attacco –COOH. Allungamento facendo reagire il carbossile attivato con gruppo NH 2 dellaa o del peptide ancorato alla resina. SPPS: sequenza di coupling/deprotezione. Distacco del peptide dalla resina

26 1972 Introduzione del gruppo 9-Fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) Louis A. Carpino

27 Side chain PG N- α PG Polymer Support SPPS

28 SPPS SCELTA DELLA RESINA ALLUNGAMENTO DELLA CATENA (COUPLING/DEPROTEZIONE) DISTACCO DEL PEPTIDE DALLA RESINA PURIFICAZIONE GIOCO DI PROTEZIONI Boc/Bzl SPPS Fmoc/tBu SPPS

29 R -OH -COOH -SH -N-

30 GRUPPO PROTETTORE chimicamente stabile nelle condizioni della sintesi peptidica effetto stabilizzante sulla molecola rimovibile in condizioni blande, in modo selettivo e con alte rese PROTEZIONE ORTOGONALE Stabile nelle condizioni di coupling e deprotezione Non stabile durante il distacco dalla resina (ci sono eccezioni) Stabile durante coupling Non stabile durante la deprotezione

31 Gruppi N protettori Boc Stabile in ambiente basico e riducente Eliminazione in ambiente acido (TFA) Fmoc Stabile in ambiente acido Eliminazione con piperidina

32 Gruppi protettori delle catene laterali BocFmoc Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ala, Met non hanno bisogno di protezione stabili in TFA Stabili in piperidina Possono essere o non essere stabili nelle condizioni di cleavage della resina

33 Racemizzazione Ossazolone

34 Bzl 2-Br-Bzl tBu Trt

35 Boc Cbz Dnp For Trt

36 Bzl OcHx tBu Ada

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38 Xan Trt Tmob

39 Mts PbfPmc

40 AcmTrt

41 Scelta della Resina Non deve essere solubile nei solventi utilizzati durante la sintesi Deve contenere siti reattivi (linkers) per permettere lattacco del primo aa tramite la funzione carbossilica Deve essere stabile nelle condizioni di coupling- deprotezione La resina deve subire un rigonfiamento (swelling) per favorire la penetrazione dei reagenti nei granuli Loading: mmol di gruppo funzionale per g di resina

42 Scelta della Resina Struttura polimerica Polistirene PEG

43 Resine Boc-SPPS Stabili in TFA Resina di Merrifield

44 Resine Boc-SPPS

45 Cleavage HF Peptide acido NH 3 /MeOH Peptide carbossammide NH 2 NH 2 Peptide idrazide MeOH/TEA Peptide metilestere

46 Resine Fmoc-SPPS Resina di Wang Anidridi simmetriche Anidridi miste Metodo MSNT/MeIm

47 Resa >70% Racemizzazione Anidridi simmetriche

48 Anidridi miste Resa >70% Racemizzazione

49 Metodo MSNT/MeIm Evita racemizzazione Sensibile allumidità

50 Resina Clorotritilica Peptidi acidi No racemizzazione Resa quantitativa Peptidi protetti

51 Rink Amide Resin Sieber Amide Resin Peptidi carbossiammidati Peptidi protetti (Sieber)

52 Resine Fmoc-SPPS Cleavage TFA 80-95% + Scavengers per 1-3 h Scavengers Nucleofili che reagiscono con specie cationiche altamente reattive che si formano dai gruppi protettori e dalla resina Acqua 1,2 Etanditiolo (EDT) Tioanisolo Fenolo Triisopropilsilano (TIS) TFA/tioanisolo/H 2 O/Fenolo/EDT Reagent K

53 Coupling Gruppo attivatore

54 Carbodiimmidi DCC DIC EDC Base Base: DIEA, TEA, NMM, DMAP O-acilisourea Migrazione acilica O N Racemizzazione

55 Carbodiimmidi + HOBt HOAtHOSu HOOBt

56 Miscellanea

57 Coupling Reagents HOBt incorporato direttamente nella struttura dellattivatore BOP Sali di fosfonio Sali di uronio HBTU

58 Sali di Fosfonio PyBOP

59 Sali di Uronio HATUTBTUHCTU

60 Siamo pronti! Fase liquida Fase Solida 1.1 eq. aa 1.1 eq. attivatore 1.1 eq. HOBt 2 eq. ammina 5 eq. aa 5 eq. attivatore 5 eq. HOBt 10 eq. ammina Gruppo COOH terminale protetto come estere Gruppo COOH terminale attaccato a resina Work-up: estrazione, purificazione Work-up: filtrazione

61 Problemi Sintesi in fase liquida: Solubilità del peptide Sintesi in fase solida: Capacità del gruppo amminico di affacciarsi al solvente

62 Risoluzione Evitare la formazione di legami idrogeno intermolecolari (Hmb)-amminoacidi Pseudoproline Isoacil dipeptidi Microonde

63 (Hmb)-amminoacidi 2-Hydroxy-4-methoxybenzyl N O acyl transfer

64 Pseudoproline X= H, CH 3

65 Pseudoproline

66 Isoacil Dipeptidi

67 Microonde

68 Ponti S-S Contribuiscono alla formazione della struttura tridimensionale di peptidi e proteine Importanti per lattività Ossidazione di due residui di cisteina

69 1 H 2 O (40 μ M) NaOH, TRIS H 2 O 2 2 AcOH/H 2 O I 2, MeOH Ac. Ascorbico

70 Distacco del gruppo Boc Si aggiunge alla resina una soluzione di TFA in DCM (50%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min. Dopo la fitrazione si aggiunge ancora TFA/DCM e si agita per ulteriori 20 min. La resina viene poi lavata con DCM (2x) e IPA (2x).

71 Distacco del gruppo Boc (Fase liquida) Lammina N-Boc-protetta viene posta in un pallone ad un collo e raffreddata a 0°C con un bagno di ghiaccio. Successivamente viene aggiunta una soluzione di HCl in diossano (4M, 1mL per 100 mg) e la miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione, a t.a. fino a quando la TLC non ha evidenziato la scomparsa del prodotto di partenza. Il solvente viene fatto evaporare ( HCl!) e il residuo ottenuto lavato con Et 2 O (x3).

72 Distacco del gruppo Fmoc Si aggiunge alla resina una soluzione di piperidina in DMF (40%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min. Dopo la fitrazione si aggiunge ancora piperidina/DMF e si agita per ulteriori 15 min. La resina viene poi lavata con DMF (6x)

73 Introduzione del gruppo Boc Lammina libera viene dissolta in un solvente opportuno (10 mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunta TEA (1 o 2 eq.) fino a pH basico ed infine Boc 2 O (2 eq.). La miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione overnight. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) si lava la fase organica con H 2 0 e una soluzione satura di NaCl. La fase organica viene seccata con Na 2 SO 4 anidro e fatta evaporare. Il grezzo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.

74 Introduzione del gruppo Fmoc Lammina cloridrata viene dissolta in una soluzione di Na 2 CO 3 (0.6M, 7 mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunto FmocOSu (2 eq.) sciolto in acetone (5 mL/mmol). La miscela di reazione è lasciata sotto agitazione per 24 h. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) la miscela viene diluita con H 2 O e la fase acquosa estratta con AcOEt (3x). Le fasi organiche riunite vengono lavate con H 2 O e una soluzione satura di NaCl, seccate con Na 2 SO 4 e fatte evaporare. Il residuo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.


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