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Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico 2005-2006 Docenti (in ordine di apparizione): P. Landini applicazioni biotecnologiche in batteri (produzione.

Copie: 1
Escherichia coli Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale.

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1 Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico Docenti (in ordine di apparizione): P. Landini applicazioni biotecnologiche in batteri (produzione di proteine eterologhe, biosensori) C. Compagno* applicazioni biotecnologiche in lieviti S. Donadio biologia degli Streptomiceti e produzione di antibiotici * Docente responsabile del corso:

2 Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico Corso modulare (argomenti diversi trattati nelle diverse parti del corso) Scopo del corso: fornire elementi su strategie e processi biotecnologici con diretti riferimenti ad applicazioni pratiche. Requisiti del corso: buone reminescenze di microbiologia, biochimica, biologia molecolare.

3 Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico Materiale Didattico: Testo di Microbiologia generale, parti riguardanti ingegneria genetica, regolazione genica, crescita batterica, microbiologia industriale (Brock, Cap. 4, 7- 8). Materiale didattico a cura dei docenti (es. articoli scientifici, link a siti internet) Le mie presentazioni sono disponibili al sito: ( DidatticaBiotecnologie Microbiche)

4 Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico Modalità desame: Prova scritta Tre domande (una per ciascuna parte del corso) Due ore di tempo Un esempio di esame verrà distribuito ed eventualmente discusso con i docenti

5 P. Landini Corso di Biotecnologie microbiche Anno accademico Biotecnologie microbiche con applicazione industriale: Produzione proteine eterologhe Produzione di molecole ad interesse biotecnologico/industriale (bioconversione) Biotecnologie microbiche con applicazione ambientale: Biorisanamento ed utilizzo di biosensori Periodo: 27/9-11/10 (il 5/10 non cè lezione)

6 Escherichia coli, Bacillus subtilis con altri batteri appartenenti ai generi Pseudomonas, Rhizobium, Lactobacillus possono essere usati: Escherichia coli, Bacillus subtilis con altri batteri appartenenti ai generi Pseudomonas, Rhizobium, Lactobacillus possono essere usati: - piani di risanamento ambientale (bioremediation/biosensori) - produzione di prodotti industriali: es. polidrossialcanoati (plastiche biodegradabili), polisaccaridi (gomme ), cellulosa - In agricoltura: pratiche di biocontrollo e preservazione delle colture (Pseudomonas) - Biotecnologie alimentari, probiotici, drug delivery - produzione di proteine eterologhe (ricombinanti) Applicazioni biotecnologie con microrganismi procarioti

7 Applicazioni biotecnologie con batteri Gram-negativi: proteine eterologhe Una delle speci batteriche più biotecnologica è senza dubbio Una delle speci batteriche più biotecnologica è senza dubbio Escherichia coli Escherichia coli Ospite per lespressione di proteine eterologhe sia procariotiche che eucariotiche dinteresse biotecnologico

8 Qual è lo scopo dellespressione di proteine eterologhe in E. coli? Ottenere una certa quantità di un prodotto proteico dinteresse purificato: ad es. enzimi catalitici per industria e ricerca (es. lipasi, proteasi), agenti terapeutici (es insulina), produzione di vaccini Ottenere una certa quantità di un prodotto proteico dinteresse purificato: ad es. enzimi catalitici per industria e ricerca (es. lipasi, proteasi), agenti terapeutici (es insulina), produzione di vaccini Utilizzare le cellule intere di E. coli che esprimono un certo enzima eterologo come biocatalizzatori (biotrasformazioni) al fine di produrre molecole organiche di alto valore aggiunto (Vitamina C, aspartame). Utilizzare le cellule intere di E. coli che esprimono un certo enzima eterologo come biocatalizzatori (biotrasformazioni) al fine di produrre molecole organiche di alto valore aggiunto (Vitamina C, aspartame).

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10 Perché utilizzare Escherichia coli? (o comunque microrganismi?) La produzione di proteine eterologhe (soprattutto per usi industriali) richiede processi che diano rese alte sia quantitativamente che qualitativamente (cioè proteina integra e biologicamente attiva) La produzione di proteine eterologhe (soprattutto per usi industriali) richiede processi che diano rese alte sia quantitativamente che qualitativamente (cioè proteina integra e biologicamente attiva) I microrganismi garantiscono il soddisfacimento di questi requisiti per: facilità di crescita, ottenimento di grandi quantità di biomassa, facilità di recupero/purificazione della proteina di interesse. I microrganismi garantiscono il soddisfacimento di questi requisiti per: facilità di crescita, ottenimento di grandi quantità di biomassa, facilità di recupero/purificazione della proteina di interesse. Vantaggi economici ed etici. Vantaggi economici ed etici.

11 Come si arriva alla produzione di proteine di interesse (eterologhe) nellospite (es. E. coli?) Clonaggio del gene corrispondente Clonaggio del gene corrispondente In modo che: Il gene venga espresso e la proteina prodotta in maniera riproducibile ed affidabile La proteina sia stabile e biologicamente attiva La proteina sia purificabile e (facilmente) riestrabile dal bioreattore

12 Escherichia coli: -proteobacteria Batterio enterico Bastoncello Gram negativo Mobilità flagellare

13 Escherichia coli (TEM x 92,750 )

14 Escherichia coli Batterio Gram-negativo Batterio Gram-negativo Enterobatterio Enterobatterio Bastoncello dimensioni 1 x 3 m Bastoncello dimensioni 1 x 3 m Anaerobio facoltativo Anaerobio facoltativo Metabolismo sia respiratorio (resp. aerobica ed anaerobica) che fermentativo Metabolismo sia respiratorio (resp. aerobica ed anaerobica) che fermentativo 3 m Agitazione (O 2 ) 3x10 9 cells/ml Statico 3x10 8 cells/ml tempo LogN Capacità di crescere in terreni definiti (minimi) Elevata velocità di crescita (tempo di generazione minuti in terreno ricco)

15 Escherichia coli Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato Presenza di plasmidi stabili Presenza di plasmidi stabili 3 m

16 Plasmidi MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA (DIMENSIONI ca kBp) DNA CIRCOLARE CHIUSO, SUPERAVVOLTO PRESENTI IN UN NUMERO DI COPIE DIPENDENTE DALLA LORO ORIGINE DI REPLICAZIONE (plasmidi generalmente usati per applicazioni biotecnologiche: copie/cellula) GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI (MARKER SELETTIVI) bla= resist. ampicillina ColE1= origine di replicazione

17 La regione di importanza clou del vettore despressione: il Multiple Cloning Site (MCS) Il gene codificante la proteina di interesse deve essere clonato (=inserito) nel vettore despressione a valle di un promotore specifico. A questo scopo il vettore di espressione contiene un multiple cloning site, cioè una sequenza ricca in sequenze di riconoscimento di nucleasi di restrizione (siti di restrizione)

18 Luso di enzimi di restrizione è alla base di gran parte delle tecnologie del DNA ricombinante Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica sul DNA e introducono un taglio a doppia elica in prossimità (Enzimi di classe I, classe III) o in corrispondenza (Enzimi di classe II) del sito di riconoscimento. Sono disponibili un alto numero di Nucleasi di restrizione di classe II che riconoscono siti di legame diversi e tagliano il DNA con risultati diversi (estremità coesive 5 o 3) o taglio blunt end.

19 Luso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse

20 Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

21 Cosa occorre per lespressione ad alto livello di una proteina nella cellula? Trascrizione/traduzione/stabilità Trascrizione/traduzione/stabilità Promotore forte (trascrizione) Presenza di segnali per il riconoscimento dellmRNA da parte dei ribosomi (traduzione) Assenza di proteasi specifiche (stabilità)

22 Il Promotore perfetto (?) A AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAn Riconosciuto dalla subunità Riconosciuti dalla subunità 4-6nt 14nt 17nt 4-6nt +1-10Ext.-35UP element +1 A An....nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-TAAnnnnn Term. (Ribosome Binding Site/ SD box (Shine-Dalgarno) Terminatore di trascrizione 5-7 nt

23 Produzione di proteine eterologhe Domanda: Domanda: Un sistema spinto al massimo, cioè alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di traduzione è il meglio che si possa avere per la produzione di proteine eterologhe? Risposta: NO Problemi di tossicità di proteine eterologhe, e della loro conformazione corretta

24 Tossicità di proteine eterologhe nellospite Escherichia coli Peso sul bilancio energetico della cellula batterica Peso sul bilancio energetico della cellula batterica Interazione erronea con componenti cellulari: Interazione erronea con componenti cellulari: Legame al DNA Danno al DNA Stress ossidativo Interazione/sequestro di altre proteine essenziali Induzione di sistemi di risposta allo stress

25 Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Produzione di proteina (unità arbitrarie)

26 Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo

27 Plac, il promotore inducibile per eccellenza AB (LacI) (naturale: allolattosio; sintetico: IPTG)

28 P lac LacI IPTG P tac Derivati di P lac * più forti P trc *) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi

29 Phage T7

30 Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol) T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dellRNA polimerasi batterica)

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32 Ara C -Ara represses P BAD +Ara induces P BAD RNA pol P BAD AraC P BAD

33 EK=Sito di proteasi Xpress epitope= riconoscimento con anticorpi specifici

34 Luso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse Ma troviamo sempre siti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare?

35 Il gene di interesse viene generalmente amplificato per PCR (polymerase chain reaction) Ibridazione con sonde specifiche per lamplificazione del gene bersaglio DNA-sintesi (15-20 nt)

36 Ai primers può essere aggiunta una coda non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT (BamHI) (HindIII) AAGCTT GGATCC

37 Ai primers può essere aggiunta una coda non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT (BamHI) (HindIII) GGATCC AAGCTT

38 Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare


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