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Trasformazione Batterica. Prerequisiti Cellula batterica Struttura del DNA Duplicazione del DNA Sintesi proteica Plasmidi Enzimi di restrizione Operoni.

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Presentazione sul tema: "Trasformazione Batterica. Prerequisiti Cellula batterica Struttura del DNA Duplicazione del DNA Sintesi proteica Plasmidi Enzimi di restrizione Operoni."— Transcript della presentazione:

1 Trasformazione Batterica

2 Prerequisiti Cellula batterica Struttura del DNA Duplicazione del DNA Sintesi proteica Plasmidi Enzimi di restrizione Operoni Amminoacidi e proteine Sostanze idrofile ed idrofobe Interazioni intermolecolari

3 Tecnologia del DNA ricombinante Insieme di tecniche di manipolazione del DNA che consentono di isolare frammenti di tale molecola, moltiplicarli, sequenziarli, mutarli e combinarli con materiale genetico proveniente da fonti differenti.

4 Escherichia Coli non patogeno crescita in terreno minimo alta frequenza replicativa buona conoscenza del suo genoma

5 Trasformazione Inserimento in batteri di materiale genetico tramite lutilizzo di plasmidi o fagi come vettori di trasformazione. Induzione della competenza CaCl 2 rende permeabile la parete cellulare dei batteri (gli ioni Ca ++ neutralizzano il DNA carico negativamente e la parete cellulare) Shock termico: ghiaccio 42°C le fenditure si dilatano facilitando lentrata del plasmide. Il DNA reso precedentemente neutro non viene respinto dalla parete cellulare anzi si avvicina ed entra nella cellula per diffusione

6 Enzimi di restrizione Tagliano le molecole di acidi nucleici riconoscendo brevi sequenze nucleotidiche a doppio filamento dette siti di restrizione

7 Ricostruzione della molecola di DNA ricombinante

8 Plasmide Gene per la resistenza allampicillina: codifica per la -lactamasi, enzima che rende inattivo lantibiotico ampicillina, distruggendo lanello -lattamico delle molecole di tale sostanza Gene per il metabolismo dellarabinosio Gene per la sintesi della GFP: proteina che, esposta ai raggi UV, emette una luce verde fluorescente. Questo gene ha, in comune con quello che codifica per l'enzima responsabile del metabolismo dello zucchero arabinosio, un promotore soggetto ad un controllo inducibile pGLO( plasmide green like organism)

9 Plasmide

10 Operone dellarabinosio Linduttore è larabinosio Larabinosio si lega con il repressore, lo inattiva e avviene lattivazione della GFP che si illumina se irradiata con UV. Insieme di geni adiacenti, alcuni dei quali sono dei geni strutturali, altri sono dei geni regolatori (operatore e il promotore).

11 Sezione pratica Versare 100 l di soluzione trasformante (TS): (50 mM di CaCl 2 crea delle fenditure nella parete cellulare.Tale sostanza rende permeabile la parete cellulare al passaggio dei plasmidi; inoltre, liberando ioni Ca ++, neutralizza le cariche negative del DNA e dei fosfolipidi di membrana favorendo lentrata della molecola nel citoplasma) Per inserire il plasmide ricombinante pGLO nelle cellule batteriche è il seguente: Marcare 2 provette eppendorf con un segno + e con un segno – per renderle distinguibili; la provetta + conterrà batteri con il plasmide ricombinante; la provetta – conterrà batteri senza il plasmide ricombinante. Incubare in ghiaccio

12 Sottoporre la provetta + ad uno shock termico, esponendola ad una temperatura di 42°C per 50 s; in questo modo si allargano le fenditure create dallazione del cloruro di calcio; rincubare in ghiaccio perché si richiudano Aggiungere 10 l di una soluzione contenente il plasmide pGLO nella provetta + Prelevare, servendosi di unansa, cellule di E. coli da una colonia batterica e immetterle nelle due provette Incubare in ghiaccio per alcuni minuti

13 Aggiungere 10 l di terreno liquido (LB); Incubare le provette eppendorf a 37°C per 30 min; in questo periodo di tempo il plasmide viene trascritto e tradotto. Successivamente si useranno dei terreni selettivi:

14 LBLB/AmpLB/Amp/Arabinosio TerrenoCellule battericheRisultato Minimo Senza plasmide ( ) Con ampicillina Senza plasmide ( ) Con ampicillinaCon plasmide (+) Con ampicillina ed arabinosio Con plasmide (+) In presenza di ampicillina soltanto i batteri in cui è stato inserito il pGLO danno origine a colonie, poiché il plasmide contiene il gene per la resistenza allantibiotico. Inoltre si può notare che lemissione di luce verde fluorescente avviene solo in presenza dellarabinosio, poiché tale sostanza è linduttore del gene che codifica per la GFP. Crescita cellulare Nessuna crescita Crescita cellulare Crescita cellulare + fluorescenza

15 Colonie di Escherichia coli

16 LB LB/Amp/Arabinosio LB/Amp Larabinosio ha indotto la produzione della proteina GFP. Le cellule trasformate hanno espresso nel loro fenotipo i nuovo geni acquisiti dal plasmide pGLO.

17 Le colonie dei batteri trasformati, esposte alla radiazione UV, emettono fluorescenza verde

18 Green fluorescence protein La GFP viene estratta dal reticolo endoplasmatico rugoso e dallapparato di Golgi della medusa tropicale Aequorea victoria.

19 Struttura della GFP La GFP è una particolare proteina che, esposta ai raggi UV, emette una luce verde fluorescente. Tale fenomeno è dovuto alleccitazione degli elettroni più esterni del cromoforo (gruppo insaturo che conferisce alla sostanza organica che lo contiene la capacità di dare colore), situato allinterno della struttura terziaria della proteina. Tale struttura, a forma di cilindro cavo, viene definita a -barile.

20 In un ambiente acquoso, grazie ai suoi atomi di carbonio la molecola può ruotare e portare la parte esterna verso linterno e viceversa si adatta allambiente. I residui idrofili degli aminoacidi che compongono la GFP sono rivolti verso lesterno; viceversa, in una soluzione salina molto concentrata, in cui gli ioni presenti attirano le molecole dacqua e la proteina risulta quindi circondata da un ambiente idrofobo, i residui idrofobi si trovano sul versante esterno del -barile. In ambiente acquosoIn soluzione salina

21 Tale strumento consiste in un tubo di vetro allinterno del quale è presente una resina formata da microscopiche sferette ricoperte da una sostanza idrofoba con caratteristiche affini a quelle della GFP. Trattando la resina con una soluzione salina di concentrazione uguale a quella dellambiente in cui è disciolta la proteina, è possibile farla interagire con i residui aminoacidici della GFP; in questo modo la proteina resta legata alla sostanza idrofoba che ricopre le microsfere, mentre le altre macromolecole cellulari sono allontanate mediante un tampone di lavaggio. Come selezionare la GFP Sfruttando le caratteristiche chimico-fisiche appena descritte, è possibile separare la GFP dal resto del materiale cellulare e dalle altre proteine per mezzo di una colonna cromatografia ad interazione idrofobica Microsferetta

22 Aggiungere 250 l di soluzione TI; la soluzione TI (ammonio solfato) è una soluzione salina molto concentrata.In seguito allaggiunta di tale soluzione i residui idrofobi degli aminoacidi della GFP si rivolgono verso lesterno della molecola; Sezione pratica Aggiungere alla soluzione contenente i batteri 250 l di soluzione TE; la soluzione TE (Tris EDTA acido etilendiamminotetracetico) è una soluzione salina a bassa concentrazione. In seguito allaggiunta di tale soluzione cresce la pressione osmotica allinterno della cellula Agitare con il vortex per 10 s al fine di favorire la risospensione delle cellule Aggiungere 10 l di una soluzione contenente la lisozima, enzima che degrada la parete delle cellule batteriche Incubare a 37°C per favorire lazione dellenzima; le cellule batteriche, la cui parete è stata degradata lisano a causa della pressione osmotica Centrifugare; in seguito a tale processo la GFP e le altre proteine solubili restano nel surnatante, mentre le macromolecole insolubili precipitano Prelevare 250 l di surnatante e spostarlo in una nuova provetta eppendorf

23 Trattare la resina della colonna cromatografica con una soluzione salina di concentrazione uguale a quella della soluzione in cui è disciolta la GFP; in seguito a tale processo i residui aminoacidici della proteina possono legarsi alla sostanza idrofoba che ricopre le microsfere Versare la soluzione contenente la GFP (500 l) nella colonna cromatografica: le macromolecole che presentano affinità per le sostanze idrofobe si separano dalle altre, rimanendo nella resina Versare nella colonna cromatografica 250 l di soluzione TL; la soluzione TL (Tampone di Lavaggio) è una soluzione salina mediamente concentrata. In seguito allaggiunta di tale soluzione solo la GFP rimane nella resina, mentre le altre macromolecole, che presentano una minore affinità con la sostanza idrofoba, vengono rilasciate; Versare nella colonna cromatografica 250 l di soluzione TE. In seguito allaggiunta di tale sostanza i residui idrofili degli aminoacidi della GFP si rivolgono verso lesterno della molecola, che perde ogni affinità con la resina della colonna cromatografica e viene perciò rilasciata; Versare la soluzione che cola dalla colonna cromatografica in diverse provette eppendorf. Esponendo la soluzione ottenuta ai raggi UV, si nota che essa emette una luce verde fluorescente, dovuta appunto alla presenza della GFP.

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