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Università di Trieste e Padova Ingegneria Chimica Ricerca di Dottorato Maria Silvia Paneni XIX Ciclo MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory -

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Presentazione sul tema: "Università di Trieste e Padova Ingegneria Chimica Ricerca di Dottorato Maria Silvia Paneni XIX Ciclo MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory -"— Transcript della presentazione:

1 Università di Trieste e Padova Ingegneria Chimica Ricerca di Dottorato Maria Silvia Paneni XIX Ciclo MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory - CASLAB Supervisore: Prof.ssa Sabrina Pricl

2 Tesi Titolo: Studio funzionale di proteine coinvolte in patologie generali e virali con tecniche di simulazione molecolare assistite al computer

3 Le Proteine a) Il malfunzionamento (uomo) b) La Buona attività (Microrganismi:Virus Batteri, funghi) Patologie

4 Approccio Interpretazione Termodinamica di: a) Relazione Causa – Effetto del cattivo funzionamento; b)Legame Farmaco – Proteina: _Wilde Type = Attività _Wilde Type = Attività _Mutazione = Resistenza. _Mutazione = Resistenza.

5 Determinare una Chiave Obbiettivo Letteratura Ing.Chimica Informatica Enti di ricerca Scambi Culturali Supporto della ricerca farmacologica Fenomeni Chimico -Fisici Modello Molecolare Modello Clinico RAZIONALE- COMPUTAZIONALE Per interpretare e prevedere

6 1. FHM - HCM Studio delle relazioni genotipo-fenotipo delle mutazioni della β-Miosina coinvolte in patologie come la cardiomiopatie ipertrofiche 1. Studio delle relazioni genotipo-fenotipo delle mutazioni della β-Miosina coinvolte in patologie come la cardiomiopatie ipertrofiche

7 1.1 Introduzione Obiettivo : Cercare un RAZIONALE tra il Modello Molecolare e quello Clinico I processi di rimodellamento possono essere meccanismi compensatori (Cell vol 104, ) il cuore diventa più grande per compensare la riduzione della forza\potenza (Miller et al 2003) il cuore diventa più grande per compensare la riduzione della forza\potenza (Miller et al 2003) Cardiovascular Istitute,University of Colorado at Denver, CO USA βMHC Mutazioni della βMHC (50% dei casi ) HCM: Eziologia oscura: Ipertrofia, disordine dei miociti, aumento del tessuto connettivo Beta-miosina + Actina = attività ATPasica driving-force (power – stroke) della contrazione

8 1.2 Metodologia Modellazione con omologia della 3D β-MHCModellazione con omologia della 3D β-MHC VALUTAZIONE del ΔΔGbind traVALUTAZIONE del ΔΔGbind tra COMPLESSO WT e MUTANTE ΔΔGbind=ΔGbind(WT) - ΔGbind(MUT) ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS metodo Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA-Kollman90),utilizzando i dati ricavati con dalla Dinamica Molecolare ΔΔGbind<0 Complesso WT più Favorito del Mutante

9 1.3 Risultati / Conclusione ΔΔGbind < 0 Abbiamo ottenuto ΔΔGbind < 0 Ecco il RAZIONALE : Ridotta Driving Force LOSS on FUNCTION EFFETTO COMPENSATORE: SLITTAMENTO delle miofibrille dal loro assetto naturale ed INGROSSAMENTO del tessuto miocardiaco MIOCARDIOPATIA IPERTROFICA Mut= Meno energia

10 1.4 Collaborazione Molecular Genetics Laboratory of the University of the Colorado, Cardiovascular Istitute, Denver, CO USA;

11 2. Antivirali - HIV 2. Studio e sviluppo di principi attivi anti – HIV: Resistenza a_Studio Farmacoforo della resistenza dellHIV a farmaci inibitori della HIV- TI b_Studio della Resistenza dellHIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Inversa

12 2. Introduzione 21.8 milioni fino ad oggi i casi di decesso per AIDS nel mondo I due siero tipi HIV1 e HIV-2 appartengono alla famiglia dei Retrovirus che è una sotto classe dei Lentivirus; Approccio: Valutare la Resistenza del HIV a inibitori della TIObiettivo TI Mutazioni Resistenza Resistenza = mutazioni per vincere il farmaco Errore di trascrizione Inibitori NNIs e NIs += Complesso Inattivo

13 2a. Metodologia 2a.Studio Farmacoforosu Indoli 2a.Studio Farmacoforo su Indoli : Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend di composti con attività nota nel caso wt e K103N e Y181C. Abbiamo stimato lattività dei nuovi composti mappandoli in tali modelli ( EC50 = concentrazione M del farmaco necessaria per bloccare lattività del virus in cellula del 50%. ) Modello 3D per HIV-1 (es) monomutante-Ricavato da trend di composti con attività nota Fucsia: Donatore legame idrogeno;HBDn Verde: Accettore legame idrogeno ;HBAc Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr

14 2a. Risultati / Conclusione Concordanza dati sperimentali e stimatiConcordanza dati sperimentali e stimati Previsioni accettabili di attività;Previsioni accettabili di attività; Sono circa 2000 con ottime attività antivirali oggetto di studio di Idenix-Novartis.Sono circa 2000 con ottime attività antivirali oggetto di studio di Idenix-Novartis. I modelli 3D ottenuti sono risultati adeguati per affrontare questo caso di studio sulla Resistenza

15 2b. Metodologia 2b.Studio con Modellazione Molecolare della Resistenza dellHIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Inversa: Va Analisi della Va =variabilità dei residui nel sito allosterico di legame NNRTIs - HIV-RT derivata sulla base della sequenza di differenti specie. Le (SCR)s hanno caratteristiche funzionali. E valutare se C andidato a Resistente Residuo C andidato a Resistente GV = ΔGAA * Va ΔGAA contributo di energia libera di legame di un dato amminoacido derivante dalla dinamica molecolare < Resistente Wang and Kollman,2001,parametro empirico 10xKi

16 2b. Risultati / Conclusione Perfetto accordo con i dati in letteratura riguardo ai residui resistentiPerfetto accordo con i dati in letteratura riguardo ai residui resistenti; Ottime previsioni su residui resistenti.Ottime previsioni su residui resistenti. Per il 9-CL TIBO : Residuo Letteratura GV Y181 Y181C K103 K103N Per il 8-CL : Residuo Letteratura GV Y181 Y181C K Valida metodologia di carattere predittivo sulla Resistenza dellHIV ai farmaci, utile per il design di migliori

17 The winner is Il suddetto lavoro dal titolo Prediction of HIV-1 Resistance to NNRTIs: a Computer-aided Molecular-based Rationale,ed I relativi risultati sono stati presentati al International Conference HIV DART 2004, Montego Bay-Giamaica dicembre 2004 ed è stato riconosciuto tra tutti quelli presenti come il migliore. Collaborazione : Idenix - Novartis Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche dellUniversità di Cagliari

18 3. Antivirali - HCV 3. Studio e sviluppo di principi attivi anti HCV a_Studio Farmacoforo di Diketoacidi Inibitori della NS5B b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dellHCV RNA dipendente RNA-polymerase

19 3. Introduzione Il 3% della popolazione mondiale è cronicamente Infetta. 85% Cronicizzazione 20% Cirrosi 75%Epatocarcinoma Obiettivo : Obiettivo : Valutazione dellattività di Inibitori Non nucleosidici e Nucleosidici della NS5B – RNA dipendente – RNA Polymerase Flaviviridae Similarità Genomica (RNA+) Hepacivirus(HCV) Pestivirus (BVDV) Flavivirus (YFV) Dengue fever virus (DENV)) Bassa repilcabilità in vitro Test in vitro su BVDV Inibitori NNIs e NIs += Complesso Inattivo NS5B

20 3a.Metodologia 3a.Studio Farmacoforosu NNI - Diketo acididerivati 3a.Studio Farmacoforo su NNI - Diketo acidi derivati: Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend di 40 molecole con attività note. Labbiamo testato su un 29 composti noti Abbiamo stimato le attività su nuovi DKAs derivati : Modello 3D di Attività Blue:Negativo ionizzabile; 1Neg I Verde: Accettore legame idrogeno ; 2HBAc Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr

21 3a.Risultati / Conclusione N In generale venivano mappati sempre 1HB Ac ( N, O ), Neg I ( al gruppo carbossile ) e 1HyAr ( Ring) Per il 90% era mappato il secondo HB Ac Per il 70% laltro Hy Ar Concordanza tra I dati sperimentali e stimati ottime previsioni; N 2 Activ:0.056 ( M ) Estimate: ( M ) N28 Activ:30 ( M ) Estimate : 25 ( M ) Il modello è risultato valido per la stima di nuovi Diketo acidi derivati inibitori della NS5B dellHCV

22 3a. Conclusione I risultati di tale lavoro sono contenuti nel articolo dal titolo :A simple but effective three-dimensional chemical feature-based pharmacophore model for diketo acid derivatives as hepatitis C virus RNA- dependent RNA-polymerase inhibitors, Journal of Medicinal. Chemistry (2005) vol 48, pp Collaborazioni: Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti"- Dipartimento di Studi Farmaceutici, Università di Roma

23 3b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dellHCV RNA dipendente RNA- polymerasecon la Modellazione Molecolare: 3b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dellHCV RNA dipendente RNA- polymerase con la Modellazione Molecolare: Recentemente Note le attività e i siti allosterici 1 de Shire A, Shire B e Pfizer 1: a 35A dal sito attivo. Recentemente scoperta lesistenza di un sito allosterico 2 di legame superficiale specifico per rGTP, locato a 30 Ǻ dal sito catalitico, nella interfaccia dita- pollice Alcuni HNIs AD1 e AD2 Alcuni HNIs AD1 e AD2, avevano mostrato unattività confrontabile con quella della Ribavirina (unico NI in commercio) Abbiamo modificato i gruppi funzionali e base azotata e valutato con la dinamica molecolare ΔGbind per ogni complesso doccato NS5B – HNI per il BVDV e HCV e calcolato le attività ΔG bind = RTlnK diss RTlnIC 50 Base Azotata 1 2 NS5B 3b. Metodologia IC50 : concentrazione M del farmaco necessaria per bloccare del 50% lattività dellenzima puro. Kroeger Smith,2000;Wang et al. 2001

24 3b. Risultati HCV BVDV Procedura validata Procedura validata: testata per i tre inibitori conosciuti ShireA e ShireB e Pfizer 1:Concordanza con lattività sperimentale e la struttura cristallografica note Concordanza dati Concordanza dati sperimentale e calcolati; Ottime previsioni Ottime previsioni ; La metodologia computazionale è risultata valida per la verifica e predizione dellattività di inibitori su HCV

25 I risultati di tale lavoro sono contenuti nel manoscritto, dal titolo:Hindered Nucleoside analogs as inibitors of HCV RNA- dependent RNA-polymerase: evolving visitas che è pubblicato in Framing the knowledge of viral hepatitis, edited by Rymond F.Schinasi, and E.R. Schiff, IHL Press Arlington MA,US, pp (2005). Collaborazioni : Dipartimento di Scienze Farmaceutiche - Università di Ferrara, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Sezione di Microbiologia, Virologia Generale e Biotecnologie Microbiche e Laboratori Cooperativi Idenix - Università di Cagliari. 3b. Risultati / Conclusione

26 4. Antifungini – Antibatterici 4. Studio Sperimentale e Computazionale dellattività Antifungina e Antibatterica di nuovi Imidazoli e Triazoli derivati

27 4.1 Introduzione M.Tuberculosis M.Tuberculosis = Bacteria Derivati Azolici = Antifungini e Antibatterici (gram positivi) Stesso meccanismo : Stesso meccanismo :Inibizione de lanosterolo C-14αdemetilasi, dipendente dal citocromo P450, Eme – thiolata proteina Candida Candida = Funghi Complex:P450 – Inibitore Azolico (struttura cristallografica) Obiettivo Nuovi Derivati Azolici Obiettivo : Valutazione dellattività di Nuovi Derivati Azolici (imidazoli e triazoli)antifungini e anti batterici

28 4.2 Metodologia La Chimica La Chimica : Sintesi e Test di Attività di Nuovi derivati Azolici (C.Albicans,Glabrata M.Tuberculosis) La parte aryl - azolyl – etano legata con legame azometino alla piridina -2- carboxamidrazone, una parte chimica che è strato dimostrato possedere un importante attività anti mycobacterica ; presso lIstituto di Scienze Farmaceutiche di Trieste.

29 La struttura del citocromo P DM del M.Tuberculosis era disponibile presso il Protein data bank codice : 1E9X Costruzione del modello 3D per Candida AlbicansCostruzione del modello 3D per Candida Albicans.Alta conservazione della struttura delle omologhe P450s.Allineamento delle sequenze aminoacidiche del citocromo P450 della C. Albicans, C. Tropicalis, C. Glabrata, C. Krsuei e M. Tuberculosis. 4.2Metodologia La Modellazione Molecolare: a) Homology Modeling:3DP450-Candida Albicans FogliettiEliche SCR

30 Homology modeling Struttura 3D de citocromo P450 Candida Albicans Centro attivo della catalisi : il nucleo di Fe- protoporphyrin ( eme)

31 b)Interazione Enzima - Farmaco Modellazione dei nuovi composti Byopolimer Modulo di INSIGHTII Docking del farmaco allinterno del sito attivo del P450 Calcolo dellEnergia di Legame: ΔGbind ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS < 0 Lenergia libera di legame ΔGbind di ciascun complesso farmaco – 14 DM in acqua è stato calcolato in accordo alla così chiamata procedura Molecular Mechanics/ Poisson –Boltzman Surface Area (MM/PBSA) Kollman90

32 4.3.1Risultati - La Chimica I nuovi Azoli hanno dimostrato attività antifungina e antibatterica. Analogia per I microrganismi – I composti 2b e 2c (quelli alogenati Br e Cl) con circa 1mg/l (Candida ) e 4mg/L ( Tuberculosis) sono risultati I più attivi. I triazoli I meno attivi. Non additività per Il 2 – pyridinecarbox-amidrazone. MIC =Conc.Minima Inibente (mg/L)-48h Candida-8g TBC MIC

33 4.3.2Risultati-ll Computazionale M.Tuberculosis 2C 2L Concordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibrioConcordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibrio dalla dimanica molecolare di composti doccati nel sito attivo

34 4.3.2Risultati–Il Computazionale C.Albicans 2C 2L Concordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibrioConcordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibrio dalla dimanica molecolare di composti doccati nel sito attivo

35 M.Tuberculosis–(kcal/mol) 4.3.2Risultati–Il Computazionale C.Albicans – (kcal/mol)

36 Concordanza fra dati calcolati e sperimentali 4.4 Conclusione Levidenza computazionale con i dati sperimentali è utile per il design di nuovi inibitori Azolici

37 I risultati di tale lavoro sono publicati nel seguente articolo : Antifungal and antimycobacterial activity of new imidazole and triazole derivates. A combined and computational approach.Journal of Antimicrobial Chemotherapy., July (2006); vol 58, pp. 76 – 84;Collaborazioni: Laboratorio di Microbiologia, Dipartimento di Scienze Biomediche e Dipartimento di Scienze Farmaceutiche di Trieste 4.4 Conclusione

38 EStata fornita Una Chiave Razionale – Computazionale proteine coinvolte in patologie generali e virali Per interpretare e predire il funzionamento delle proteine coinvolte in patologie generali e virali. La modellistica molecolare integrata allanalisi clinica è un valido strumento per la ricerca nel campo medico-farmaceutico. Concludendo Goal:

39 Ringraziamenti Dott.ssa Mestroni L. Prof.ssa Mamolo M.G. Prof.ssa Banfi E. Prof. Vio L. Prof. La Colla P. Prof. Di Santo R. Prof. Manfredini S. Idenix - Novartis Staff del MOSE-CASLAB


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