alla metodica di patch-clamp

Presentazione sul tema: "alla metodica di patch-clamp"— Transcript della presentazione:

1 alla metodica di patch-clamp
Biofisica della comunicazione cellulare e trasporto ionico di membrana: dai pesci elettrici alla metodica di patch-clamp F. Gambale Convegno AIF Brescia, 4 Dicembre 2008

2 Elettricità ed elettrofisiologia dal settecento ai giorni nostri …
… dall’organismo alla struttura molecolare dei trasportatori di membrana …

3 animali, piante e perfino in batteri…
… in diversi organismi, animali, piante e perfino in batteri… … proprietà conservate nelle proteine trasportatrici di membrana: il punto di vista del Bio-Fisico

4 L’elettricità animale è nota all’uomo fin dall’anticità
I pesci elettrici (Electrophorus elettrico o Torpedo marmorata), ed i meccanismi con cui con cui essi neutralizzano le prede, sono stati oggetto di studio e dibattito già tra gli antichi greci (Dialoghi di Platone e scritti di Plutarco), nel mondo arabo (Abd al-Latif XII Secolo) e successivamente a partire dal XVII secolo a seguito della scoperta dei pesci elettrici del nuovo mondo.

5 Le proprietà elettriche della torpedine risiedono in un organo muscolare modificato formato da circa un migliaio di colonne perpendicolari, ciascuna delle quali contiene 150 partizioni (Hunter 1773), ognuna costituita da più cellule. Per gli studi sulla torpedine e per l’identificazione della natura elettrica del torpore indotto dalla torpedine, John Walsh fu insignito della Copley medal da parte della Royal Society (1775).

6 In parallelo agli studi di Cavendish, Hunter e Walsh sui pesci elettrici, esperimenti sull’elettricità animale venivano condotti da Luigi Galvani sulla torpedine e sulla giunzione neuro-muscolare di rana ... Studi che culminarono nell’ipotesi sulla trasmissione dei segnali elettrici “De viribus electricitatis in motu muscolari commentarius”, Galvani 1791, in cui la giunzione neuro-muscolare è equiparata ad una “bottiglia di Leida animale”.

7 Volta elettro-fisico Gli studi sull’elettricità animale furono determinanti per la scoperta dei potenziali elettrovoltaici da parte di Volta (20 Marzo 1800) e quindi furono alla base di una svolta epocale per la moderna società industriale. Volta, dopo una fase iniziale di adesione per gli studi di Galvani, avversò l’ipotesi dell’esistenza di una elettricità animale in favore di segnali elettrici negli animali unicamente indotti dagli archi bimetallici … Varie forme della Pila di Volta In alto una versione portatile che evoca l’anguilla elettrica

8 Volta elettrofisiologo
… al tempo stesso Volta, oltre ad essere “elettricista”, fu anche valente elettrofisiologo; tuttavia questo suo contributo non fù molto riconosciuto. Infatti egli stesso ebbe a lamentarsi del fatto che, a fronte dei riconoscimenti per l’invenzione della pila, poco conto veniva dato per gli altri suoi studi di natura elettrofisiologica. Faceva riferimento agli esperimenti sulle sensazioni di gusto indotti da metalli sulla lingua, sulla stimolazione del nervo acustico e del nervo olfattivo.

9 Volta elettrofisiologo
In realtà Volta piegò la sperimentazione elettrofisiologica alla misura dei fenomeni elettrofisici È questo il caso delle sensazioni gustative usate per misurare la polarità degli archi metallici e la stessa scala dei metalli (serie voltaica) molto prima di avere strumenti fisici adeguati alla misura, Oppure l’intensità dello shock elettrico indotto da diverse bottiglie di Leyda su operatori per misurare la resistenza del suo elettrogeneratore.

10 … il dibattito sui fenomeni elettrici anche in altri sistemi biologici era avanzato nei primi anni dell’800 come testimoniato dai libri che menzionavano “l’irritabilité vegétale” (di matrice Halleriana) come un parametro cruciale di importanti funzioni cellulari vegetali …

11 Oggi sappiamo che i meccanismi molecolari responsabili dell’elettricità cellulare risiedono nella membrana plasmatica e dipendono dalle condizioni interne ed esterne alla cellula … … in particolare dalle concentrazioni ioniche, essenziali per la sopravvivenza della cellula e per la comunicazione tra cellule.

12 In particolare la trasmissione di segnali elettrici dipende dai trasportatori di membrana tra cui i canali ionici, proteine specializzate che svolgono un ruolo essenziale per favorire il passaggio di ioni attraverso il doppio strato lipidico. exchanger

13 Per arrivare alla formulazione di una moderna teoria di membrana si dovette attendere la metà del secolo scorso… … in particolare la teoria di Bernstein (1902) che ipotizzava che il potenziale d’azione dei neuroni dipendesse da un rapido aumento della permeabilità della membrana e sopratutto gli esperimenti condotti dal 1939 al 1952 da Hodgkin ed Huxley (premi Nobel nel 1963) e la loro teoria sul ruolo dei canali del K+ e del Na+ nel potenziale d’azione … Nel frattempo, il potenziale del nervo era stato registrato per la prima volta da Hermann von Helmotz nel 1850 che aveva anche misurato una velocità di conduzione del segnale lungo il nervo di 27 m/s.

14 Il potenziale elettrico di una cellula è determinato dalla separazione di carica (di cui sono responsabili canali e/o pompe ioniche) …

15 L’evidenza diretta dell’esistenza di proteine specializzate per il trasporto ionico fu ottenuta solo nel 1976 da Neher e Sackmann (Nobel nel 1991) con la metodica di patch-clamp Assone gigante prima del 1976 Muscolo di rana denervato, 1976 Questa metodica aprì la strada allo studio elettrofisiologico di cellule di qualsiasi dimensione (fino a pochi m), cambiando radicalmente la visione del trasporto elettrogenico in cellule e, per certi aspetti, della biologia cellulare.

16 Gli ultimi passi sono rispettivamente del con il clonaggio e l’espressione eterologa in ovociti di rana (Xenopus laevis) del canale recettore dell’acetilcolina da Torpedo californica da parte di Shosaku Numa e del 1998 con la cristallizzazione e la modellizzazione molecolare dei canali del potassio, KcSA, dal batterio Streptomyces lividans da parte di Roderick MacKinnon (Premio Nobel 2003) ancora i pesci elettrici un altro premio Nobel

17 Oggi si sa che i canali partecipano alle più importanti funzioni fisiologiche che vanno …
dal controllo del battito cardiaco alla regolazione della produzione di insulina nelle cellule pancreatiche Per esempio, difetti genetici nei canali causano malattie ereditarie che vanno dall’aritmia cardiaca agli scompensi dell’apparato muscolare, al diabete. Esistono evidenze che alcuni canali ionici possano essere coinvolti nei meccanismi di proliferazione cellulare che portano alla formazione di tumori.

18 Correlazione struttura-funzione
L’approccio integrato basato su metodiche di biologia molecolare, cristallizzazione (e diffrazione di raggi X) ed elettrofisiologia consente di avere informazioni utili per la correlazione tra struttura e funzione dei canali ionici Schrempf et al. (EMBO J. 1995) Identificazione Di un canale al potassio di Streptomyces lividans Doyle et al. (Science 1998; R. MacKinnon) Prima struttura cristallografica di un canale K+ daStreptomyces lividans, KcSA Jiang et al. (Nature 2003; R. MacKinnon) Prima struttura di un canale dipendente dal potenziale, KvAP Correlazione struttura-funzione

19 E. coli spheroplasts (≈5 m)
Per riassumere: passi + recenti nello studio dei canali ionici H. Helmotz, Ludwig, DuBois, Fick ~1840 Trasporto di acqua e ioni mediato da ‘Kanale’ Hodgkin-Huxley 1952 Trasporto di sodio e potassio nell’assone Giant squid axon (mm) Neher-Sakmann 1976 Patch-clamp e rilevazione di canali in cellule isolate Frog smucle (≈10 m) Numa Sackmann 1982 Clonaggio (MN) ed espressione del canale dell’acetilcolina in ovociti di Xenopus (BS) 1 mm Hedrich et al. 1986 Canali in cellule vegetali Protoplasts (≈10 m) Martinac et al. 1987 Canali in sferoplasti batterici giganti E. coli spheroplasts (≈5 m) Carpaneto et al. 2003 Canali nei poriferi (sponge Axinella polypoides) Metazoa Sugrue and Hay 1991 Proteina M2, canale ionico virale Virus < 1 m

20 Le difficoltà tecniche per le registrazione dei segnali di canali e trasportatori ionici dipendono dalle dimensioni e caratteristiche delle cellule oggetto dell’indagine Protoplast Neurons Vacuole Sponge cells

21 … anche nei microrganismi è stato possibile rilevare i canali che talvolta vengono usati per attaccare gli ospiti Questo è il caso di batteri, lieviti e virus …

22 Elementi strutturali importanti dei canali ionici regolati dal potenziale
. Filtro di selettività Poro di permeazione Gating & sensore del potenziale

23 Come gli antichi elettrofisici-elettrofisiologi studiavano gli animali e loro proprietà, il moderno biofisico (con l’elettrofisiologia, la cristallografia risolta a livello atomico, la fluorescenza, le varie spettroscopie e la biologia molecolare) formula ipotesi sulla correlazione tra struttura e funzioni delle proteine di trasporto. … in questi studi è evidente il collegamento tra l’approccio fisico e biologico. Thus investigation of ion channel proteins bridge fundamental physics with function of biologically critical proteins R. S. Kass (2005) The channelopathies. J. Clin. Invest. 115:

24 Nelle prossime diapositive seguono alcuni esempi pratici di come un Bio-Fisico, elettrofisiologo, erede di Volta e Galvani, può affrontare lo studio del trasporto di membrana in modo unitario, perché opera a livello dei meccanismi molecolari elementari simili in diversi sistemi viventi. Per esempio, al livello delle malattie genetiche o delle patologie oppure dei meccanismi che consentono di produrre vegetali con maggiore efficienza, o più sani o di interesse biotecnologico.

25 Membrane patch- clamped (bloccato) a potenziale costante
La metodica di patch-clamp applicabile a cellule di qualsiasi dimensione (fino a pochi m) Patch-clamp Membrane patch- clamped (bloccato) a potenziale costante IR=V i.e I=g·V

26 Le proprietà elettriche della membrana sono monitorate con uno “microscopico stetoscopio”, cioè una pipetta di vetro con una punta di diametro di circa 1 micronmetro. All’amplificatore

27 Diverse configurazioni di patch-clamp

28 Elementi di un sistema di patch clamp Elettrodi Disco Petri con cellule e soluzione fisiologica Gabbia di Faraday per lo schermaggio del rumore elettrico Manipolatori idraulici e meccanici Sistema computerizzato ed elettronica per il controllo del potenziale applicato e la registrazione delle correnti Microscopio invertito Amplificatore Programmi e protocolli di stimolazione prefissati dall’operatore Tavolo antivibrante

29 I canali possono essere anche espressi e studiati mediante espressione eterologa in ovociti di Xenopus o in altre cellule isolate… … tramite un sistema di voltage-clamp a due elettrodi o ancora con patch-clamp

30 Segnali di singolo canale

31 Un canale X1000 Migliaia di canali
L’APERTURA SINCRONIZZATA DI TANTE SINGOLE PROTEINE DA LUOGO ALLA FORMAZIONE DI CORRENTI MACROSCOPICHE DI FORMA ED INTENSITA’ MOLTO DIVERSE Un canale Migliaia di canali X1000

32 Correnti ioniche mediate da canali dipendenti dal potenziale in cellule dell’ipofisi (a sinistra) e da cellule di Arabidopsis thaliana (a destra) Outward Currents I I 200 ms I(au) I(au) V(mV) V(mV) Potassium currents in Arabidopsis protoplasts

33 Si può osservare che le proprietà dei canali ionici in piante ed animali sono relativamente simili
Solo le cinetiche sono sensibilmente diverse (le piante non possono fuggire davanti ai predatori). Tutto ciò consegue dal fatto che i geni che codificano per i canali cambiano molto lentamente (circa 10-4 cambiamenti xAA xmilione di anni).

34 I canali del potassio dipendenti dal potenziale in vegetali mediano sia il rilascio di K+ dalla cellula che l’ingresso di potassio nella cellula … La struttura dei canali da organismi diversi e le loro funzioni a livello molecolare sono simili ma il contributo alla sopravvivenza di un organismo sono diverse Canali del potassio dipendenti dal potenziale in cellule isolate da mais

35 Queste differenze funzionali dipendono da modeste variazioni nella sequenza primaria e nella struttura dei canali ionici. Per esempio la topologia dei canali ionici dipendenti dal potenziale è simile, a diversi livelli, in eucarioti e procarioti … anche in piante e batteri in SNC animali in animali Virus

36 … il canale del potassio di tipo “inward” è in grado di selezionare ioni con diametri molto simili (da 0.6 a 1.5 Å) ... Cs=1.69 Å 1.33 1.50 0.60 0.95

37 I canali dell’assone gigante del calamaro hanno selettività del tutto simili

38 … oltre alle variazioni della struttura determinate dalle mutazioni naturali, una variabilità aggiuntiva è costituita dalla formazione di tetrameri eteromerici dei canali al potassio di tipo Shaker … homotetramero heterotetramero

39 La formazione di canali al potassio eteromerici (i
La formazione di canali al potassio eteromerici (i.e formati da diverse subunità) è una strategia conveniente adottata da molti organismi viventi (animali e piante) per rispondere a condizioni di stress. Per esempio Il canale vegetale KDC1 da solo non è in grado di formare canali ionici omomerici ma forma canali ionici funzionali in ovociti Xenopus laevis con altre subunità di canali al potassio. KDC1 modifica le caratteristiche di altri canali.

40 Meccanismi simili sono importanti anche per il canale al potassio ed altri canali oligomerici di animali, in alcuni casi responsabili di gravi patologie genetiche. Per esempio Il mutante R420H del canale KV3.3 non forma canali funzionali in ovociti di Xenopus e modifica le proprietà di altri canali al potassio, quali KV3.1 e KV3.4. E’ stato suggerito che queste mutazioni ed eteromerizzazioni (con altre subunità di canali del K+) possano essere responsabili di malattie neurodegenerative quali l’Atassia spinocerebellare Dominante. KV3.3 espresso da solo (1:0) o coespresso con R420H (nei rapporti indicati) Waters et al., Natural genetics, 2005

41 Atassia Cerebellare Dominante
Disturbo nervoso, dovuto a malfunzionamento del sistema cerebrospinale, che provoca la mancanza di coordinazione dei movimenti dei muscoli volontari Comporta mancato coordinamento della deambulazione, della postura e arti, disartria* e/o difetti oculomotori. * difficoltà nell'articolazione delle parole.

42 Alcune patologie genetiche da canali (canalopatie)

43 Riflessione Alla stessa stregua di Volta, l’elettrofisiologo moderno utilizza la caratterizzazione funzionale (oggi supportata dalla microscopia ed altre metodiche) dei canali per acquisire, in un’ottica riduzionista, informazioni sulla struttura di queste proteine e sul loro ruolo negli organismi biologici complessi.

44 Conclusioni: Abbiamo …
- … collocato gli studi sul trasporto ionico di membrana in un contesto storico che dal 1700 porta ai giorni nostri. - … messo in evidenza il contributo degli studi elettrofisiologici alle attuali conoscenze sull’elettricità. … illustrato alcuni meccanismi molecolari conservati in organismi molto diversi. … evidenziato il contributo della biofisica delle membrane all’integrazione tra fisica e biologia.

45 Il gruppo di lavoro 6 Biologi + 5 Fisici
Alessandro Bisignano System manager, Jolly Monica Bregante Oocytes KDC1 Phytoremediation Alessia Naso Molecular biology Achim Scholz-Starke Vacuoles Armando Carpaneto Vacuoles, Oocytes, transporters Paolo Soliani Biophysics of KDC1 Cristiana Picco Oocytes KDC1 Shira Corem Vacuoles in hyperaccumulators Carlotta Ivaldi Student Roberta Montisci Molecular biology