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1 DNA struttura e replicazione Cromosomi. 2 Nei primi decenni del 900 si raccolgono evidenze che i cromosomi sono costituiti da DNA e proteine. - Qual.

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1 1 DNA struttura e replicazione Cromosomi

2 2 Nei primi decenni del 900 si raccolgono evidenze che i cromosomi sono costituiti da DNA e proteine. - Qual è la molecola responsabile dellinformazione biologica? - Qual è la sua struttura? Esperimenti di importanza fondamentale (Griffith, Avery et al., Hershey et al.) vengono effettuati negli anni su organismi semplici, quali batteri e batteriofagi e dimostrano che il materiale genetico è il DNA

3 E. Chargaff scopre che nel DNA di specie diverse cè proporzionalità nella composizione in basi azotate: cè proporzionalità nella composizione in basi azotate: organismo A% A%T%G%C% Pneumococco lievito Riccio di mare E.coli uomo ratto La quantità totale delle purine (A+G) è uguale a quella delle pirimidine (T+C)

4 4 Cristallografia a raggi X (1952 R. Franklin) L immagine di diffrazione ottenuta è compatibile con una struttura elicoidale R. Franklin M. Wilkins

5 5 Nel 1953 James Watson e Francis Crick, basandosi sulle osservazioni di cristallografia ai raggi X di Rosalind Franklin e sullosservazione di Erwin Chargaff, propongono il modello a doppia elica per la molecola di DNA

6 6 Il DNA è un polimero di nucleotidi Nucleotide: molecola formata da uno zucchero pentoso (desossiribosio), un gruppo fosfato e una base azotata (A, C, G, T) A G T C purine pirimidine

7 7 Il DNA ha una struttura ad elica (in accordo coi dati di cristallografia) a doppio filamento Il DNA ha una struttura ad elica (in accordo coi dati di cristallografia) a doppio filamento Gli scheletri zucchero-fosfato sono posizionati esternamente, mentre le basi sono dirette verso linterno e si appaiano (tramite legami Gli scheletri zucchero-fosfato sono posizionati esternamente, mentre le basi sono dirette verso linterno e si appaiano (tramite legami idrogeno) alle basi complementari del filamento opposto in accordo con quanto osservato da Chargaff (in tutti i DNA % A = % T; % C = % G). Lappaiamento è sempre purina-pirimidina e questo mantiene il diametro dellelica uniforme I due filamenti sono antiparalleli I due filamenti sono antiparalleli Modello a doppia elica del DNA

8 8 Il diametro si mantiene costante perché le purine si appaiano alle pirimidine 2nm G C: 3 legami H A = T: 2 legami H

9 9 Il modello prefigurava genialmente una modalità di replicazione semiconservativa che verrà poi sperimentalmente dimostrata da Meselson e Stahl nel 1958 Ogni filamento dellelica funziona da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, sfruttando la complementarietà delle basi

10 10 Modelli di replicazione del DNA Alla fine del processo di sintesi potremmo ottenere: due molecole di DNA ciascuna costituita a un filamento di nuova sintesi e da un filamento originario (semiconservativa) una molecola di DNA costituita da due filamenti parentali e laltra da due filamenti di nuova sintesi (conservativa) due molecole di DNA costituite entrambe da unalternanza di filamenti nuovi e parentali (dispersiva) Filamento parentale Filamento nuovo

11 11 La replicazione del DNA è semiconservativa: ciascuno dei due filamenti parentali serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove doppie eliche sono costituite da ognuna da un filamento vecchio e da un filamento nuovo

12 12 DNApolimerasi DNA polimerasi

13 13 nucleotide (nucleoside trifosfato): elemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleici

14 14 La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato (nucleotide) allestremità 3OH

15 15 La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato allestremità 3OH

16 16 Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in direzione opposta Direzione di sintesi

17 17 Replicazione del DNA

18 18 Replicazione del DNA 1 In corrispondenza delle origini di replicazione lelicasi svolge i filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi e generando due filamenti singoli In corrispondenza delle origini di replicazione lelicasi svolge i filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi e generando due filamenti singoli Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e lo stabilizzano Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e lo stabilizzano helicase Denaturazione del DNA Origin of replication

19 19 Replicazione del DNA 2 La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex novo la sintesi, ma solo di allungare un 3 preesistente) La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex novo la sintesi, ma solo di allungare un 3 preesistente) La DNA polimerasi III estende linnesco a RNA sintetizzando DNA La DNA polimerasi III estende linnesco a RNA sintetizzando DNA helicase innesco 3 helicase

20 20 La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa direzione di avanzamento della elicasi e quindi in maniera continua … Ma cosa succede sul filamento complementare? helicase Leading strand

21 21 primase 3 5 helicase Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera discontinua, attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di Okazaki) 5

22 22 Replicazione del DNA 3 Rimozione del primer a RNA e gap filling da parte della DNA pol I Rimozione del primer a RNA e gap filling da parte della DNA pol I Saldatura dei frammenti (ligasi) Saldatura dei frammenti (ligasi) 5 helicase ligase helicase 5

23 23 La direzione di sintesi della DNA pol. è sempre 5 3 uno dei due nuovi filamenti è sintetizzato in maniera discontinua, i frammenti vengono poi saldati

24 24 La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi. Complessivamente lenzima ha una struttura dimerica, che contiene due copie di ciascuna subunità e due siti catalitici La DNA polimerasi III agisce come un dimero a livello della forca replicativa

25 25 La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi. Complessivamente lenzima ha una struttura dimerica, che contiene due copie di ciascuna subunità e due siti catalitici La DNA polimerase III agisce come un dimero a livello della forca replicativa

26 26 topoisomerasi Le Topoisomerasi hanno il compito di rilassare (eliminare) le tensioni che si creano nella doppia elica del DNA in seguito ai processi cellulari che implichino un cambiamento di topologia del DNA (trascrizione, replicazione del DNA) La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei superavvolgimenti

27 27

28 28 Caratteristiche delle DNA polimerasi Necessità di innesco (causa: geometria del sito attivo, effetto: accuratezza) Necessità di innesco (causa: geometria del sito attivo, effetto: accuratezza) Attività esonucleasica 3-5 correzione di bozze (effetto: direzione di sintesi SOLO 5- 3) Attività esonucleasica 3-5 correzione di bozze (effetto: direzione di sintesi SOLO 5- 3)

29 29 Replicazione del DNA circolare Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI ORI è sequenza ricca in A-T Nei procarioti lorigine di replicazione è singola

30 30 Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multiple Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI multiple

31 31 Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multiple Le DNA polimerasi eucariotiche hanno una velocità di incorporazione di 75 nucleotidi al secondo La lunghezza media di un cromosoma umano è 1.4 x 10 8 bp (3.2 x 10 9 bp genoma aploide/ 23 cromosomi) Se ci fosse una singola ORI, per duplicare un singolo cromosoma medio occorrerebbero più di 10 giorni In realtà la fase S dura circa 8 ore

32 32 Il cromosoma batterico ha ununica ORI Il genoma di E. coli è lungo 4.6x10 6 bp La velocità dellla Pol III arriva fino a 1000 nt/ sec Per replicare il cromosoma occorrono: 4.6x10 6 bp = 70 min c.a 1000nt/sec su ogni lato della forca replicativa quindi 35 min c.a

33 33 Alla DNA polimerasi è associata unattività esonucleasica che consente la correzione di bozze= rimozione di nucleotidi errati (tasso di errore durante la sintesi 1 x nt; dopo correzione 1x nt). Con questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessi dalla DNA pol mentre la replicazione è in corso

34 34 Nel genoma umano (aploide) ci sono c.a. 3 x10 9 nt di questi solo 6 x 10 7 nt (il 2%) sono sequenze codificanti (esoniche) Se non ci fosse correzione di bozze (tasso di errore durante la sintesi 1x nt): 6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA Dopo correzione di bozze ( 1x nt ): mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA (1 mutazione ogni 166 replicazioni) Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché intervengono dei processi di riparazione del DNA

35 35 RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair) provvede ad effettuare una scansione del DNA dopo la replicazione alla ricerca di appaiamenti errati Il sistema di riparazione è in grado di riconoscere e riparare il filamento di nuova sintesi

36 36 Un errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazione successivi

37 37 Difetti nel mismatch repair Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti nel mismatch repair sono associate al cancro. La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si accumulano in tutto il genoma e che, quando colpiscono geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non poliposico ereditario HNPCC, autosomica dominante)

38 38 Cromosomi

39 39 Cromatina Allinterno del nucleo della cellula eucariotica si trova la cromatina (DNA genomico + proteine) La cromatina appare organizzata in entità separate (cromosomi) quando la cellula è in mitosi interfase tarda profase inizio anafase

40 40 centromero = telomeri Ciascun cromosoma prima della mitosi è costituito da due cromatidi fratelli, tenuti insieme dal centromero braccio p braccio q

41 41 Telomeri Sequenze ripetute allestremità dei cromosomi Sequenze ripetute allestremità dei cromosomi costituiti da alcune migliaia di ripetizioni di sequenze brevi costituiti da alcune migliaia di ripetizioni di sequenze brevi nelluomo: (TTAGGG)n nelluomo: (TTAGGG)n Proteggono il cromosoma dalla degradazione ad opera di nucleasi ed impediscono che le estremità dei cromosomi si saldino tra di loro Proteggono il cromosoma dalla degradazione ad opera di nucleasi ed impediscono che le estremità dei cromosomi si saldino tra di loro

42 42 Telomeri Nelle cellule germinali e nelle cellule staminali la lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni divisione cellulare grazie allattività della telomerasi Nelle cellule germinali e nelle cellule staminali la lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni divisione cellulare grazie allattività della telomerasi Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni replicazione del DNA il telomero subisce un accorciamento Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni replicazione del DNA il telomero subisce un accorciamento La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca arresto della crescita cellulare e apoptosi La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca arresto della crescita cellulare e apoptosi

43 43 Replicazione dellestremità del cromosoma

44 44

45 45 Centromero È la regione del cromosoma in cui i cromatidi fratelli sono uniti È la regione del cromosoma in cui i cromatidi fratelli sono uniti Sequenza ripetute, eterocromatina Sequenza ripetute, eterocromatina In corrispondenza del centromero ci sono due cinetocori (uno per cromatidio) che servono ad agganciare il cromosoma alle fibre del fuso In corrispondenza del centromero ci sono due cinetocori (uno per cromatidio) che servono ad agganciare il cromosoma alle fibre del fuso

46 46 Lunghezza del DNA genomico Distanza tra due coppie di basi 0.34nm Distanza tra due coppie di basi 0.34nm 3x10 9 bp (numero di basi di un genoma aploide umano) x 0.34nm (distanza tra due coppie di basi) = 1 metro (lunghezza di un genoma umano aploide) 3x10 9 bp (numero di basi di un genoma aploide umano) x 0.34nm (distanza tra due coppie di basi) = 1 metro (lunghezza di un genoma umano aploide) Deve essere compattato in un nucleo di pochi Deve essere compattato in un nucleo di pochi

47 47 Nucleosoma Lunità fondamentale della cromatina è il nucleosoma: tratto di DNA (146bp) avvolto con c.a. due giri attorno a un core formato da un ottamero istonico Lunità fondamentale della cromatina è il nucleosoma: tratto di DNA (146bp) avvolto con c.a. due giri attorno a un core formato da un ottamero istonico Istoni: proteine cariche positivamente (arg, lys) che interagiscono coi gruppi fosfato del DNA Istoni: proteine cariche positivamente (arg, lys) che interagiscono coi gruppi fosfato del DNA 11 nm

48 48 (1.65 giri, 146 pb) Ottamero istoni: 2 molecole di H2A, H2B, H3 e H4 H3 H4 H2A H2B H2A H4 11 nm

49 49 Istone H1 e fibra da 30nm Listone H1 (di giunzione) ha la funzione di compattare ulteriormente i nucleosomi Listone H1 (di giunzione) ha la funzione di compattare ulteriormente i nucleosomi Promuove la formazione della fibra solenoide da 30nm Promuove la formazione della fibra solenoide da 30nm H1

50 50 Il cromosoma metafasico presenta un alto grado di compattazione della cromatina

51 51 Livelli di compattamento DNA avvolto attorno allottamero + DNA linker = 200bp c.a. DNA avvolto attorno allottamero + DNA linker = 200bp c.a. 200bp x 0.34 nm = 70nm 200bp x 0.34 nm = 70nm Il compattamento nella fibra da 11nm è di c.a. 7X Il compattamento nella fibra da 11nm è di c.a. 7X

52 52 Livelli di compattamento Listone H1 lega il DNA linker e forma la fibra solenoide da 30nm Listone H1 lega il DNA linker e forma la fibra solenoide da 30nm Nella fibra da 30nm ci sono 6 nucleosomi, quindi limpaccamento è di 40X Nella fibra da 30nm ci sono 6 nucleosomi, quindi limpaccamento è di 40X

53 53 Eucromatina-eterocromatina Eterocromatina è più compatta e trascrizionalmente inattiva Eucromatina interfasica trascrizionalmente attiva; si trova allo stato di cromatina distesa ed è accessibile agli enzimi della trascrizione

54 54 a eucromatina: frazione nucleare trascrizionalmente attiva e a bassa densità sezione al microscopio elettronico a b b eterocromatina: frazione frazione trascrizionalmente trascrizionalmente inattiva ed elettrondensa inattiva ed elettrondensaEucromatina-eterocromatina

55 55 Nelle femmine di mammifero uno dei due cromosomi X è inattivato Il cromosoma X inattivo è visibile nel nucleo interfasico di cellule come una masserella di cromatina condensata, addossata alla membrana nucleare Viene chiamata cromatina sessuale o corpo di Barr Nuclei di cellule della mucosa orale di (sinistra) e (destra)

56 56 Cariotipo Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e dalla morfologia (posizione del centromero e dimensioni) dei suoi cromosomi metafasici

57 57 Il cariotipo umano Nel 1955 Tjio e Levan (analizzando centinaia di metafasi in 5 tessuti provenienti da 7 individui) dimostrano che il numero esatto di cromosomi umani è 46

58 58 Cromosomi umani #1 22 sono uguali nel maschio e nella femmina (autosomi) #1 22 sono uguali nel maschio e nella femmina (autosomi) La 23 esima coppia è quella dei cromosomi sessuali: La 23 esima coppia è quella dei cromosomi sessuali: XX nella femmina (sesso omogametico) XY nel maschio (sesso eterogametico)

59 59 Denaturazione e rinaturazione del DNA

60 60 Rinaturazione in presenza di una sonda La sonda è una sequenza di DNA complementare a una determinata sequenza di interesse, che viene marcata con radioattivo o con fluorocromi sonda

61 61 Ibridazione del cromosoma con sonde fluorescenti Cromosomi metafasici su vetrino;Denaturazione del DNA; Rinaturazione in presenza di un eccesso di sonda fluorescente specifica per una determinata regione del cromosoma

62 62 Ibridazione del cromosoma con sonde fluorescenti

63 63 …AATCCCAATCC TTAGGG* sonda telomero

64 64 Fluorescent In Situ Hybridization

65 65 Origine evolutiva del cromosoma 2 umano

66 66 Origine evolutiva del cromosoma 2 umano: fusione di cr 12 e cr 13 di pan troglodites Sequenze telomeriche


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