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CORSO DI IMMUNOLOGIA per il corso di Laurea in biotecnologie a.a. 2005-2006 II semestre DOCENTE: Dott.ssa Vladia Monsurrò Dipartimento di patologia Sezione.

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1 CORSO DI IMMUNOLOGIA per il corso di Laurea in biotecnologie a.a II semestre DOCENTE: Dott.ssa Vladia Monsurrò Dipartimento di patologia Sezione di immunologia Universita degli Studi di Verona ORARIO DELLE LEZIONI: lunedì: 4:00-5:30 giovedì 4:00-5:30 dal 20 marzo al 25 maggio 2006 aula F Facolta di Scienze

2 DOVE TROVARE LE LEZIONI on line: In materiale didattico Per qunato riguarda il programma e lesame e come discusso in classe

3 PROGRAMMA LEZIONI Mar 21 Marzo lezione 1Generalità sul corso Il sistema immunitario (Introduzione) Giov 23 Marzo lezione 2Cellule e tessuti del sistema immunitario Lun 27 Marzo lezione 3Riconoscimento dellantigene: Molecole del Sistema Immunitario: Antigeni e anticorpi Giov 30 Marzo lezione 4MHC (Major histocompatibility complex) Lun 3 Aprile lezione 5MHC-Antigene: Sua captazione, processamento e presentazione. Giov 6 Aprile lezione 6TCR Antigeni tumorali e immunoterapia (in preparazione del talk) Lun 10 Aprile lezione 7Maturazione, attivazione e regolazione dei linfociti: Maturazione dei linfociti ed espressione dei recettori (genetica Ig e TCR) Giov 13 Aprile lezione 8Immunita e tumori Parmiani Talk (ore 17:00)-vedi volantino

4 Giov 20 Aprile lezione 9Attivazione linfocitaria, trasduzione del segnale. Lun 24 Aprile lezione 10Attivazione dei linfociti B e produzione di Ab Giov 27 Aprile lezione 11Tolleranza immunologica Giov 4 Maggio lezione 12Meccanismi effettori Citochine, Immunita innata Lun 8 Maggio lezione 13Meccanismi effettori dellimmunita cellulo- mediata, reazioni DTH Giov 11 Maggio lezione 14Meccansimi effettori dellimmunita umorale complemento Lun 15 Maggio lezione 15Rapporti tra fisiologia e patologia Ipersensibilità concetti generali Ipersensibilità di tipo I Giov 18 Maggio lezione 16Test prove esami-recupero Merc 7 giugno e 28 giugnoESAMI

5 I RECETTORI PER GLI ANTIGENI: IG MHC TCR

6 STRUTTURA FONDAMENTALE DI UNA MOLECOLA DI IMMUNOGLOBULINA: catene PESANTI catene LEGGERE due catene pesanti (isotipo oppure,,, ) due catene leggere (isotipo k o ) ponti disolfuro che legano tra loro le due catene pesanti e ciascuna catena leggera ad una catena pesante

7 regioni COSTANTI CH3CH3 CH2CH2 CLCL CH1CH1 VHVH VLVL regioni VARIABILI REGIONI COSTANTI E REGIONI VARIABILI

8 STRUTTURA FONDAMENTALE DI UNA MOLECOLA DI IMMUNOGLOBULINA catena leggera: -1 dominio variabile V L -1 dominio costante C L catena pesante: 1 dominio variabile V H 3 o 4 domini costanti C H, a seconda dell'isotipo CH3CH3 CH2CH2 CLCL CH1CH1 VHVH VLVL

9 Struttura molecolare degli anticorpi:

10 PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

11 I RECETTORI PER GLI ANTIGENI: IG MHC TCR

12 RICONOSCIMENTO DELLANTIGENE : - linfociti B antigene in forma nativa -linfociti T antigene processato da cellule accessorie (cellule presentanti lantigene )

13 I linfociti T contro microbi intracellulari e lattivazione di altre cellule (macrofagi e linfociti B)

14 Le APC (=Antigen Presenting Cell) PROFESSIONISTE presentano lantigene processato ai linfociti T associato alle molecole MHC Cellula dendritica recettore MHC legante lantigene processato in peptidi Macrofago Linfocita B

15 MHC-II Linfocita T helper e suoi recettori e co-recettori per lantigene Antigene processato Linfocita T citotossico, suoi recettori per l'antigene e co-recettori CD8 MHC-I Le molecole MHC-I presentano l Ag ai T citotossici Le molecole MHC-II presentano l Ag ai T helper Cellula dendritica PRESENTAZIONE DELLANTIGENE CAPTATO DALLESTERNO E PROCESSATO DA PARTE DELLE CELLULE DENDRITICHE Antigene processato

16 MOLECOLE MHC struttura e genetica

17 MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) è il locus dove mappano gli HLA È chiamato così perché storicamente e stato associato ai rigetti di trapianto (altamente polimorfico e immunogeno). Cosa significa MHC?

18 Un allele è una variante di un gene polimorfo Un individuo è: Omozigote se ha 2 alleli uguali Eterozigote se ha 2 alleli differenti

19 Topi singenici hanno tutti i geni identici Due ceppi allogenici sono due gruppi di topi singenici differenti fra loro

20 IL COMPLESSO GENETICO MHC VENNE INIZIALMENTE IDENTIFICATO COME REGIONE GENETICA CHE CONTROLLAVA IL RIGETTO DEI TRAPIANTI TRA TOPI DI CEPPI INBRED DIVERSI (Snell-1940) Benacerraf e McDevitt scoprirono tra gli anni 1960/1970 che il complesso MHC controllava anche la RISPOSTA ANTICORPALE contro determinati antigeni proteici, ed era diversa a seconda degli alleli MHC di ciascun ceppo Questo perchè alcuni peptidi li legavano e generavano rispost aT helper, altri no Esistono dei geni di istocompatibilità

21 centromero telomero centromero telomero Regione MHC nelluomo e nel topo

22 Map of the human MHC. This map is simplified to exclude many genes that are of unknown function. HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-J, and HLA-X are class I-like molecules; HLA-H does not appear to be involved in the immune system. C4, C2, B, complement proteins; DM, TAP, proteasomes, proteins involved in antigen processing; HLA, human leukocyte antigen; HSP, heat shock protein; LT, TNF, cytokines centromero telomero Regione MHC nelluomo

23 Collocazione dei geni MHC e dei geni MHC-relati sui cromosomi umani

24 Gli MHC nelluomo sono chiamati HLA (antigeni leucocitari umani) perche identificati per vie sierologiche mediante Ab che riconoscevano i leucociti durante le trasfusioni

25 © 2003 by LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS Nomenclature of human leukocyte antigen (HLA) loci and alleles NomenclatureDefinition HLAThe HLA region and prefix for an HLA gene HLA-DRB1A particular HLA locus (i.e., DRB1) HLA-DRB1 * 13A group of alleles that encode the DR13 antigen defined serologically by microlymphocytotoxicity or by mixed lymphocyte reactivity HLA-DRB1 * 1301A specific HLA allele HLA- DRB1 * 1301N A null allele (i.e., nonexpressed) HLA- DRB1 * An allele that differs by a synonymous mutation (i.e., identical amino acid encoded by a different codon) HLA- DRB1 * An allele that contains a mutation outside the coding region HLA- DRB1 * N A null allele that contains a mutation outside the coding region NOMENCLATURA HLA

26 . © 2003 by LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS Fundamental Immunology Renal graft survival improves with fewer human leukocyte antigen (HLA) mismatches. Cumulative data for graft survival are plotted as a function of time. Curves 1, 2, and 3 represent the groups with no class II HLA mismatches and four or fewer class I HLA mismatches, whereas curve 4 shows the graft survival of those with fewer than two class II mismatches and no class I mismatch. The worst survivals are clearly those with both HLA class I and class II mismatches

27 RICONOSCIMENTO ANTIGENICO NEI TRAPIANTI

28

29 Gli alleli dell MHC sono altamente polimorfici Codominanti Cl I e Cl II sono distinte ma omologhe

30 POLIMORFISMO DELLE MOLECOLE MHC Un allele ad un locus genetico che abbia una frequenza Un allele ad un locus genetico che abbia una frequenza 0.01 è denominato rara variante allelica è denominato rara variante allelica. Un allele con una frequenza 0.01 (ma 1) è definito Un allele con una frequenza 0.01 (ma 1) è definito come polimorfico. Gli alleli ai loci MHC sono polimorfici poichè presentano Gli alleli ai loci MHC sono polimorfici poichè presentano sempre frequenze elevate nella popolazione. Il polimorfismo è concentrato negli esoni che codificano Il polimorfismo è concentrato negli esoni che codificano per i domini che legano il peptide e il TCR.

31 NUMERO DI ALLELI HLA AD ALCUNI LOCI I loci MHC presentano un numero molto elevato di alleli:

32 Frequenze alleliche in popolazioni diverse

33 I geni MHC sono espressi in maniera codominante

34 Struttura dellMHC

35 Similitudini Cl I e Cl II 1.Hanno una tasca di legame per il peptide, due domini Ig, dominio transmembrana e dominio citoplasmatico 2.Il polimorfismo e nella tasca 3.Le zone non polimorfe legano i recettori CD4 o CD8

36 Secondo la regola: 1 gene-1 catena polipeptidica -1 gene per la catena STRUTTURA SCHEMATICA DELLE MOLECOLE MHC CLASSICHE

37 Similitudini ClI e Cl II 1.Hanno una tasca di legame pe ril peptide, due domini Ig, dominio transmembrana e dominio citoplasmatico 2.Il polimorfismo e nella tasca 3.Le zone non polimorfe legano i recettori CD4 o CD8

38 STRUTTURA DEL TCR

39 T cell recognition of a peptide-MHC complex. This schematic illustration shows an MHC molecule binding and displaying a peptide and a T cell receptor recognizing two polymorphic residues of the MHC molecule and one residue of the peptide. Details of the interactions among peptides, MHC molecules, and T cell receptors are described in Chapters 4, 5, and 6.

40 Modello delle interazioni molecolari tra MHC-II/peptide, TCR e CD4, e MHC-I/peptide, TCR e CD4 MHC-I TCR CD8 APC o cell. bersaglio MHC-II TCR Cellula T CD4 CD4 si lega al dominio 2 di MHC-II CD8 si lega al dominio 3 di MHC-I

41 MHC Cl I

42 2 tipi di Molecole MHC-I classiche, MHC-Ia: HLA-A,-B,-C (uomo) H-2K,-D,-L (topo) sono polimorfiche e legano peptidi antigenici che presentano ai TCR associati a CD8 Essendo codominanti ogni cellula ne esprime 6 diverse non classiche, MHC-Ib: CD1 H2-M3 MICA nFcR Rae1 Presentano polimorfismo molto limitato e spesso il solco di legame con il peptide è molto ridotto

43 STRUTTURA SCHEMATICA DELLE MOLECOLE MHC Catena : 2-microglobulina, 12kD Catena : 44-47kD 2 catene polipeptidiche e associate non covalentemente con strutture secondarie costituite da foglietti e -eliche. Peptide 8-10 aa

44 MHC Cl II

45 STRUTTURA SCHEMATICA DELLE MOLECOLE MHC Catena : 32-34kD Catena : 29-32kD 2 catene polipeptidiche e associate non covalentemente con strutture secondarie costituite da foglietti e -eliche. Peptide fino a 30 aa

46 Circa 20 possibili combinazioni perche DQ puo legarsi anche a DP e DR, sia materno che paterno

47 Le molecole MHC-I ed MHC-II completamente assemblate sono eterotrimeri, composti da: 1.una catena ; 2.una catena ; 3.il peptide antigenico nella tasca. Lespressione stabile sulla membrana cellulare richiede la presenza di tutti e tre i componenti.

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49 CDR= ragione che determina la complementarieta Ig= immunoglobulina Kd= costante di dissociazione MHC= complesso maggiore di istocompatibilita VH= dominio variabile della catena pesante VL= dominio variabile della catena leggera

50 Legame MHC-antigene

51 Similitudini ClI e Cl II 1.Hanno una tasca di legame pe ril peptide, due domini Ig, dominio transmembrana e dominio citoplasmatico 2.Il polimorfismo e nella tasca 3.Le zone non polimorfe legano i recettori CD4 o CD8

52 La variabilità delle sequenze aminoacidiche tra i diversi alleli ad un locus è diversa a seconda del dominio molecolare: è concentrata nei domini che legano il peptide.

53 Polymorphic residues of a class I MHC molecule. The polymorphic residues of class I and class II MHC molecules (shown as red circles) are located in the peptide-binding clefts and the a-helices around the clefts. In the class II molecule shown (HLA-DR), essentially all the polymorphism is in the b chain. However, other class II molecules in humans and mice show varying degrees of polymorphism in the a chain and usually much more in the b chain.

54 Peptide binding to MHC molecules. A. These top views of the crystal structures of MHC molecules show how peptides (in yellow) lie on the floors of the peptide-binding clefts and are available for recognition by T cells. The class I molecule shown is HLA-A2, and the class II molecule is HLA-DR1. Note that the cleft of the class I molecule is closed, whereas that of the class II molecule is open. As a result, class II molecules accommodate longer peptides than do class I molecules. (Courtesy of Dr. P. Bjorkman, California Institute of Technology, Pasadena.) B. The side view of a cut-out of a peptide bound to a class II MHC molecule shows how anchor residues of the peptide hold it in the pockets in the cleft of the MHC molecule. (From Scott CA, PA Peterson, L Teyton, and IA Wilson. Crystal structures of two I-Ad-peptide complexes reveal that high affinity can be achieved without large anchor residues. Immunity 8: , Copyright 1998, with permission from Elsevier Science.)

55 MHC-I: peptide di 8-10 AA MHC-II: peptide anche di più di 30 AA

56 Rappresentazione della localizzazione di un peptide legato nella tasca formata dai domini 1 e 2 di una molecola MHC-I. Peptide (in viola) Molecole di acqua (sfere azzurre)

57 MHC-binding residues and T cell receptor contact residues of a model peptide antigen. The immunodominant epitope of the protein hen egg lysozyme (HEL) in H-2k mice is a peptide composed of residues The ribbon diagrams modeled after crystal structures show the surface of the peptide-binding cleft of the I-Ak class II molecule and the bound HEL peptide with amino acid residues (P1-P9) indicated as spheres (A) and with side chains (B). Mutational analysis of the peptide has shown that the residues involved in binding to MHC molecules are P1 (Asp52), P4 (Ile55), P6 (Gln57), P7 (Ile 58), and P9 (Ser60); these are the residues that project down and fit into the peptide-binding cleft. The residues involved in recognition by T cells are P2 (Tyr53), P5 (Leu56), P8 (Asn59), P10 (Arg61), and P11 (Trp62); these residues project upward and are available to T cells. (From Fremont DH, D Monnale, CA Nelson, WA Hendrickson, and ER Unanue. Crystal structure of I-A in complex with a dominant epitope of lysozyme. Immunity 8: , Copyright 1998, with permission from Elsevier Science.)

58 - le molecole MHC hanno una certa promiscuità nel legame col peptide; -ogni molecola MHC-I o -II possiede una sola tasca di legame con il peptide, che può ospitare, in momenti diversi, molti peptidi differenti, ma con alcune caratteristiche strutturali in comune ; - la fine specificità del riconoscimento antigenico è dovuta prevalentemente alla selettività del TCR; - il legame dei peptidi alle molecole MHC è uninterazione non covalente tra residui AA del peptide e residui AA della tasca della molecola MHC, saturabile a bassa affinità, con bassi tassi di associazione e di dissociazione; - le molecole MHC di un individuo non distinguono tra peptidi estranei (es. da Ag microbici) e peptidi self (= da Ag derivati da proteine proprie). Caratteristiche delle interazioni peptide-MHC:

59 Antigen competition for T cells. A T cell recognizes a peptide presented by one MHC molecule. An excess of a different peptide that binds to the same MHC molecule competitively inhibits presentation of the peptide that the T cell recognizes. APC, antigen-presenting cell.

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61 Lista di alcuni peptidi trovati associati a molecole MHC-I

62 Schema dellinterazione MHC-I/peptide

63 Schema dellinterazione MHC-II/peptide Lista di alcuni peptidi trovati associati a molecole MHC-II

64 Scoperta di epitopi: iTOPIA (filmino)

65 Monsurro and Nagorsen ASHI Q 2002 Tumor cell CD3 2- microglobulin HLA CD8 TCR epitopes TAP TAA CTL CD3 CD8 TCR 2- microglobulin HLA epitopes

66 Avidin labeled with PE tHLA PE Biotinilated monomer 2 microglobulin Soluble tagged HC (HLA) peptide Refolding and biotinylation

67 CD8FITC tPE CD8FITC Tumor cell CD3 2- microglobulin HLA CD8 TCR epitopes TAP TAA CTL Monsurro and Nagorsen ASHI Q 2002

68 0i 8i 16i 24i CD8 FITC t209-2M PE 0% 0.4% 0.3% 2.2% Kinetics of expansion of vaccine specific CD8+ cells (ex vivo) Monsurro Blood 2005

69 Utilizzo biotecnologico dellMHC Tetrameri (filmino)

70 Enhancement of class II MHC expression by IFN-g. IFN-g, produced by NK cells during innate immune reactions to microbes or by T cells during adaptive immune reactions, stimulates class II MHC expression on antigen-presenting cells (APCs) and thus enhances the activation of CD4+ T cells. IFN-g has a similar effect on the expression of class I MHC molecules and the activation of CD8+ T cells

71 The end

72 Treatment: MART in IFA g209-2M in IFA g209-2M in IFA + IL-2 (720,000 IU/Kg TID) Rosenberg et al. Nature Med,1998 Response rate after peptide-based vaccinations against melanoma Responses Patients %

73 Come è possibile che le molecole MHC presentino un numero di peptidi diversi sufficiente a coprire la maggior parte delle proteine antigeniche ? Attraverso duplicazione genica ed elevato polimorfismo: tanti loci codificanti per molecole simili alleli polimorfici allo stesso locus codominanza

74 Ricadute del polimorfismo dellMHC sull immunopatologia : Trapianti Suscettibilità a varie patologie, spesso autoimmuni E importante in alcuni casi tipizzare i pazienti per il genotipo MHC

75 Corrispondenza tra gli esoni dei geni MHC e i domini della struttura proteica MHC-I MHC-II

76 Ereditarietà dellMHC nelluomo

77 Lista degli alleli HLA di classe II

78 Lista degli alleli HLA di classe I


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