DIAGNOSI MICROBIOLOGICA

Presentazione sul tema: "DIAGNOSI MICROBIOLOGICA"— Transcript della presentazione:

1 DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
L’ANTRACE: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Antonio Goglio Microbiologia e Virologia AO Ospedali Riuniti di Bergamo Antrace 4 -

2 Diagnosi microbiologica
Il ruolo dei laboratori di microbiologia clinica consiste essenzialmente nell'effettuare una diagnosi presuntiva Tutti i laboratori debbono essere in grado di sospettare la presenza di B. anthracis Nel sospetto il campione e/o le colture devono essere inviate ad un laboratorio, che possegga aree di lavoro corrispondenti al terzo livello di contenimento (P3), per la diagnosi definitiva. Antrace 4 -

3 B.anthracis è aerobio e anaerobio facoltativo
immobile, sporigeno e, se ceppo virulento, capsulato non-emolitico su agar sangue di montone sensibile alla penicillina (salvo rarissimi ceppi, più spesso modificati) può presentarsi in due diverse forme: in forma vegetativa (1-1,5 x 3-8 m) in forma di spora (1 m). Antrace 4 -

4 B.anthracis: forma vegetativa
la forma vegetativa (fase di attiva moltiplicazione) è quella che si riscontra nelle lesioni cliniche, nei relativi campioni biologici e di conseguenza nelle colture microbiologiche solo la forma vegetativa è in grado di produrre le tossine (antigene protettivo, fattore letale, fattore edemigeno) e la capsula , due dei fattori di virulenza tale forma vegetativa è facilmente distrutta dai disinfettanti comunemente utilizzati in ospedale, in particolare da quelli a base di cloro Antrace 4 -

5 B.anthracis: spore la forma di spora (fase di quiescenza) è quella che il microorganismo acquista in situazione di svantaggio e gli consente la sopravvivenza (in presenza di ossigeno atmosferico, nella terra e nel suolo, in acqua, polveri, pellami, ….) solo nel momento in cui si ritrova in un ambiente favorevole (inoculazione di spore attraverso lesioni cutanee, ingestione con acqua o alimenti, inalazione di un’elevata quantità di spore) riprende la capacità di moltiplicarsi e di dare danno le spore sono particolarmente resistenti nell’ambiente (sopravvivono anni) e non sono distrutte dai comuni disinfettanti Antrace 4 -

6 Biosicurezza (1) B. anthracis non è contagioso da persona a persona
L'infezione cutanea avviene solo attraverso soluzioni di continuo della cute e la forma da inalazione necessita di una elevata carica di spore, per cui il rischio di trasmissione in laboratorio è praticamente nullo Per i campioni potenzialmente infetti, adottare misure almeno del 2° livello di contenimento (cappa a flusso di classe 2 con filtri HEPA, indumenti di protezioni personale -camici monouso, guanti di lattice, mascherine, occhiali o schermi di protezione-) Antrace 4 -

7 Biosicurezza (2) Le procedure devono essere eseguite da microbiologi o tecnici di microbiologia esperti Nel caso si giunga ad una identificazione presuntiva della presenza di B.anthracis, è sconsigliato allestire ulteriori procedure identificative. Il campione e/o la coltura devono essere inviati ad un laboratorio di riferimento per la diagnosi definitiva. Antrace 4 -

8 Decontaminazione Le superfici che possono essere state a contatto con materiali infetti devono essere decontaminate con prodotti a base di cloro in concentrazione di: 5.000 ppm (es. ipoclorito di sodio 5,25% -la comune candeggina- diluito 1:10) * ppm (come sopra, diluendo 1:5) ** Gli altri materiali devono essere autoclavati seguendo le procedure in vigore nel laboratorio per i materiali infetti il CDC consiglia l’uso di diossido di cloro (gas) per il trattamento di ambienti contaminati da spore CDC, Guidelines for State Health Dpt ( ) PHLS Provisional guidelines for action in the event of a deliberate release ( ) Antrace 4 -

9 Esame diretto dei campioni clinici
Allestire due vetrini con uno striscio del materiale in esame: fissarli per 1 minuto con etanolo assoluto oppure 10 min con metanolo Colorare un vetrino con il Gram e uno con il Giemsa e osservarli al microsopio in immersione La presenza al Gram di grossi bacilli Gram-positivi (1-1.5 X 2-8 mm), con estremità squadrate e in corte catene di 2-4 cellule suggerisce la presenza di B. anthracis La colorazione di Giemsa può mettere in evidenza la presenza di capsula Antrace 4 -

10 Gram di B. anthracis da sangue di scimmia (1000x)
Antrace 4 -

11 Gram di B. anthracis da agar sangue (1000x)
Antrace 4 -

12 Gram di B. anthracis con spore (1000x)
Antrace 4 -

13 Esame colturale (1) Tampone nasale semina diretta su piastre di AS
utile anche semina dopo trattamento termico o con alcool per eliminare la flora commensale stemperare il tampone in 1 ml circa di diluente (soluzione fisiologica o brodo) e sottoporre la sospensione a shock termico (bagnomaria a 65°C per 10 min.), oppure a shock etanolico (aggiungere pari volume di alcool etilico assoluto per 30 min.) dopo trattamento possono essere seminate, per inondazione, una o più piastre di AS con 0,1 ml della sospensione. Antrace 4 -

14 Esame colturale (2) Altri campioni
B.anthracis cresce rapidamente sui comuni terreni colturali, ma non su MacConkey allestire una coltura su Agar Sangue di montone (AS): su questo terreno è possibile evidenziare alcune caratteristiche distintive di B.anthracis allestire in contemporanea colture su altri tipi di terreni, secondo le procedure in uso nel laboratorio per i diversi tipi di campioni clinici incubare a 35°-37° C in un termostato ad aria per ore Antrace 4 -

15 Caratteristiche colturali (1)
Aspetto delle colonie (su AS dopo ore a 35-37°C) colonie di 2-5 mm, biancastre, a vetro smerigliato, rotonde o irregolari, piane o leggermente convesse, con margini frastagliati e proiezioni a forma di virgola che protrudono dal bordo della colonia (aspetto a “caput Medusae”) non emolitiche, a differenza di quelle di altre specie, quali B. cereus e B. thuringiensis, che producono su AS beta emolisi (emolisi completa) con consistenza notevole, appiccicose e filanti, quando raccolte con un'ansa Antrace 4 -

16 Caratteristiche colturali (2)
Aspetto delle colonie (su Agar cioccolato dopo ore a 35-37°C) mucose, se il ceppo è capsulato la capsula si forma in presenza di CO2, o in terreni contenenti bicarbonato di sodio 0,7% Antrace 4 -

17 Caratteristiche colturali (3)
La rapidità di crescita (12-15 ore ) di B. anthracis può essere sfruttata per isolare il microrganismo da una coltura mista Al Gram i batteri cresciuti su AS in aria: non presentano capsula appaiono come lunghe catene di bacilli Gram-positivi contengono spore, più o meno numerose, centrali o subterminali, ovali, che non dilatano il corpo batterico. Antrace 4 -

18 Morfologia delle colonie di B
Morfologia delle colonie di B. anthracis (da agar sangue, dopo ore) Antrace 4 -

19 Colonie “appiccicose” di B. anthracis, da agar sangue
Antrace 4 -

20 Test addizionali Antrace 4 -

21 B. cereus (destra) e B. anthracis (snistra), su agar sangue, dopo 24 ore
Antrace 4 -

22 Fonti bibliografiche ISS (www.iss.it) JAMA, 1999, Consensus statement
N Engl J Med, 1999, Dixon e al. CDC ( PHLS ( links: Antrace 4 -