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FACOLTA DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN NEUROBIOLOGIA CLASSE DI LAUREA MAGISTRALE IN BIOLOGIA (6S) TESI DI LAUREA.

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1 FACOLTA DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN NEUROBIOLOGIA CLASSE DI LAUREA MAGISTRALE IN BIOLOGIA (6S) TESI DI LAUREA STUDIO DELLE CORRENTI STRETCH-ATTIVATE NELLE CELLULE MICROGLIALI: PROPRIETA ELETTRICHE E CARATTERIZZAZIONE UNIVERSITA DEGLI STUDI DI ROMA LA SAPIENZA Candidato: Giordano Caterina Relatore Interno: Prof. De Stefano Maria Eagle N. Matricola: 678843 Dip. Di Biologia Cellulare e dello Sviluppo Relatore Esterno: Prof. Ragozzino Davide Dip. Fisiologia umana e Farmacologia Anno Accademico 2012-2013

2 Nicola J. Allen and Ben A. Barres : Glia - more than just brain glue Nature,2009 LE CELLULE GLIALI --- MACROGLIA --astrociti --oligodendrociti e cellule di Schwann --- MICROGLIA cellule responsabili della risposta immunitaria che si ha in seguito ad uninfezione o insulto a carico del SNC.

3 FUNZIONI DELLE CELLULE MICROGLIALI Le cellule microgliali sono dei guardiani attivi e dinamici del parenchima cerebrale --- movimento tramite il riarrangiamento dei processi citoplasmatici --- stato di resting (forma ramificata) e stato attivato (forma ameboide) --- produzione e rilascio di citochine, chemochine, mediatori del processo infiammatorio

4 Il flusso dello ione cloro partecipa a diverse attività microgliali: --- regolazione del volume cellulare --- ramificazione, attivazione, migrazione, proliferazione, fagocitosi, apoptosi. Nilius B, Eggermont J, Voets T, Droogmans G. (1996): Volume activated Cl- channels. Gen. Pharmacol.; 27: 1131–1140. Eder C, Klee R, Heinemann U. (1998): Involvement of stretch-activated Cl- channels in ramification of murine microglia. The Journal of Neuroscience; 18(18):7127–7137. IL RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI DEL CLORO NELLA MICROGLIA Cl - IAA-94 FFA DIDS ClC-3?

5 IL CLORO PARTECIPA AL MANTENIMENTO DEL POTENZIALE DI MEMBRANA NELLE CELLULE MICROGLIALI --- canali ionici aperti in condizioni passive --- trasportatori E Cl = RT/zF ln [Cl - ] i /[Cl - ] e. Equazione di Nernst Equazione di Goldman-Hodgkin e Katz Gli ioni sono sollecitati da due forze che tendono a farli spostare da un lato allaltro della membrana, una forza motrice chimica (gradiente di concentrazione) e una forza motrice elettrica (ddp ai due lati della membrana). Il valore del potenziale di membrana al quale queste 2 forze si eguagliano, viene definito potenziale di equilibrio per quello ione.

6 I CANALI IONICI PER IL TRASPORTO DEL CLORO 1)---- canali attivati da ligandi extracellulari (GABA-R e glicina-R) 2)---- canali attivati da ligandi intracellulari (CaCC) 3)-----canali voltaggio-dipendenti 4)---- CFTR (cAMP-activated cystic fibrosis trans membrane conductance regulator) 5)---- canali attivati da stimoli sensoriali (attivati dallo stiramento (stretch) della membrana) La natura molecolare dei canali ionici stretch-attivati permeabili al cloro non è ancora chiara. Tra le proteine che potrebbero essere considerate come dei probabili candidati ci sono: ---Mdr o glicoproteina-P (Pgp), ---la proteina FXYD1, ---le proteine ClC (DAnglemont et al,. 2003). --canali ionici --trasportatori

7 Nei mammiferi si distinguono nove geni ClC divisi in tre gruppi in base allomologia di sequenza. I canali ClC-2 e ClC-3 sono stati proposti come possibili candidati dei canali del cloro stretch-attivati. CANALI DEL CLORO STRETCH-ATTIVATI: FAMIGLIA GENICA ClC ClC-2 -- conduttanza anionica --voltaggio-dipendente ClC-3 --costitutivamente aperto --conduttanza anionica --assenza di unidentità molecolare per la mancanza di inibitori farmacologici specifici. DAnglemont et al., (2003): Structure and pharmacology of swelling sensitive chloride channels, I Cl,swell. Fundamental & Clinical Pharmacology.; 17: 539–553.

8 LA TECNICA ELETTROFISIOLOGICA DEL PATCH CLAMP B. Sakmann e E. Neher (premio nobel per la Fisiologia e Medicina 1991) Cell-attached Whole-cell

9 UNO STIMOLO IPOTONICO ATTIVA UNA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI DI FETTINE DI IPPOCAMPO 270 mOsm

10 LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE FETTINE DI IPPOCAMPO VIENE INIBITA DAI BLOCCANTI DEI CANALI ANIONICI IAA-94 FFA IAA-94 DIDS

11 LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA E TRASPORTATA DALLO IONE CLORO

12 1)-- CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DELLA CORRENTE DI CLORO STRETCH- ATTIVATA 2)-- MOVIMENTO DEL CLORO NELLE CELLULE BV-2 TRASFETTATE CON IL SENSORE DEL CLORO LA LINEA CELLULARE MICROGLIALE BV-2 Studio del movimento del cloro tramite tecniche di fluorescenza ---- funzioni cellulari (per es. riarrangiamento dei processi citoplasmatici)

13 MISURA DELLA CONCENTRAZIONE INTRACELLULARE DEL CLORO MEDIANTE TECNICHE DI IMAGING La misura diretta della concentrazione intracellulare del cloro nelle cellule, è resa difficile da due caratteristiche: un basso rapporto delle [Cl - ] tra lambiente intracellulare ed extracellulare, approssimativamente 10:1 e una driving force molto ridotta,in quanto il potenziale di inversione del cloro si avvicina molto al potenziale di riposo delle cellule. Piotr Bregestovski, Tatyana Waseem and Marat Mukhtarov,(2009); Genetically encoded optical sensors for monitoring of intracellular chloride and chloride-selective channel activity. Front. Mol. Neurosci. 2, 1-15. Cl - 1:10

14 MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DI CLORO INTRACELLULARE MEDIANTE SONDE FLUORESCENTI 1)--- fluorofori di derivazione chinolinica (SPQ, MEQ e MQAE). 2)--- espressione endogena di cromofori (GFP e YFP). 3)--- lindicatore raziometrico Clomeleon (CFP + TFP). SVANTAGGI ---eccitazione con UV. ---alta sensibilità alle variazioni del pHi. ---scarsa sensibilità di legame al cloro. --- tossicità. Kuner et al., (2000). A genetically encoded ratiometric indicator for chloride: capturing chloride transient in cultured hippocampal neurons. Neuron 27,447-459.

15 Il Cl-sensor: un indicatore raziometrico e non invasivo VANTAGGI --- elevata sensibilità di legame al cloro (EC 50 = 30 mM). Clomeleon (EC 50 = 90 mM) ---Fluorecence ratio (R) = F445/F485 Il Cl-sensor è una proteina di fusione costituita dalla CFP unita, tramite una regione linker di 20 amminoacidi, ad una forma mutata della YFP (YFP-H148Q/ I152L/V163S). Markova O, Mukhtarov M, Real E, Jacob Y, Bregestovski P., (2008): Genetically encoded chloride indicator with improved sensitivity. Journal of Neuroscience Methods.; 170 : 67–76.

16 NELLE CELLULE SOTTOPOSTE AD UNO STRESS OSMOTICO, DOVUTO AD UNA SOLUZIONE IPOTONICA, SI OSSERVA LATTIVAZIONE DI UNA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA ISOTONICAIPOTONICAISOTONICA 286 mOsm 205 mOsm

17 UNO STIMOLO IPOTONICO ATTIVA UNA CORRENTESTRETCH-ATTIVATA, AD ANDAMENTO RETTIFICANTE, NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 IPOTONICA

18 LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE BV-2 VIENE INIBITA DALL ACIDO FLUFENAMICO

19 LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 E TRASPORTATA DALLO IONE CLORO

20 LA CORRENTE STRETCH-ATTIVATA NELLE CELLULE MICROGLIALI BV-2 E TRASPORTATA DALLO IONE CLORO [ Cl - ] i = 144 mM [Cl - ] e = 100 mM [ Cl - ] i = 0 mM X

21 1) --- potenziale di riposo delle cellule BV-2 2) --- potenziale di equilibrio del cloro delle cellule BV-2 Il valore sperimentale del potenziale di riposo è stato misurato utilizzando la tecnica del patch-clamp nella configurazione di whole-cell, osservando il valore di potenziale a cui si registra una corrente netta uguale a zero. La media dei potenziali di riposo misurata è stata -40 ± 4 mV (n=27). IL FLUSSO DEL CLORO NELLE CELLULE TRASFETTATE CON IL Cl-SENSOR Parametri importanti per vedere lingresso del cloro nelle cellule: Cl- Sensor --Proteina di fusione tra CFP e YFP*** --Indicatore raziometrico (R=F445/F485 )

22 MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DI CLORO INTRACELLULARE Equazione di Nernst E Cl = RT/zF ln [Cl - ] i /[Cl - ] e. E cl = 58 log 10,3/150 = -67 mV

23 Allo scopo di ottenere un segnale di fluorescenza più chiaro del movimento del cloro, indotto dallo stimolo ipotonico, abbiamo utilizzato delle soluzioni extracellulari ad alta concentrazione di potassio (60 mM), per depolarizzare le cellule, aumentare la driving force che agisce sullo ione e vedere lentrata del cloro. [K + ] i = 140 mM[K + ] e = 4 mM [K + ] e = 60 mM Cl - LA DEPOLARIZZAZIONE DELLE CELLULE BV-2, PERMETTE DI VEDERE UN FLUSSO DI CLORO INTRACELLULARE

24 NELLE CELLULE TRASFETTATE CON IL SENSORE DEL CLORO SI OSSERVA UN MOVIMENTO DI CLORO INTRACELLULARE

25 CONCLUSIONI Cl - Stiramento 1) Le cellule BV-2 presentano una corrente attivata da stimoli ipotonici tipica della microglia: trasportata da ioni Cl - inibita dallacido flufenamico, un bloccante dei canali anionici 2) In cellule che esprimono il sensore del Cl -, si osservano direttamente i flussi di Cl -.associati allattivazione della corrente Cl - Cl-sensor Distribuzione locale e dinamica del cloro


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