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Il protocollo sperimentale e i calcoli in laboratorio Fabio Fusi Dipartimento di Scienze Biomediche.

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Presentazione sul tema: "Il protocollo sperimentale e i calcoli in laboratorio Fabio Fusi Dipartimento di Scienze Biomediche."— Transcript della presentazione:

1 Il protocollo sperimentale e i calcoli in laboratorio Fabio Fusi Dipartimento di Scienze Biomediche

2 Il protocollo sperimentale

3 Informazioni sullanimale di laboratorio Specie utilizzata (ratto, topo, cavia, ecc.) Ceppo Ditta fornitrice Sesso Peso ----> età Digiuno (sì - no) Eventuali trattamenti (reserpinizzato, ecc.) Anestesia Metodica di sacrificio Note Sprague-Dawley outbred rats

4 Informazioni sulle soluzioni preparate Soluzioni fisiologiche di perfusione Soluzioni madri Pesata Diluizione Raccomandazioni per la conservazione della soluzione madre Note (preparare fresca ogni giorno, agitare prima delluso, ecc.)

5 Analisi dei risultati Raccolta dei tracciati, stampati, ecc. Immagazzinamento dei dati nel computer Catalogazione Elaborazione dei dati raccolti Produzione di un grafico

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7 Annotazioni Le annotazioni/osservazioni spesso forniscono le informazioni più importanti per la comprensione dei risultati e quindi dellintero esperimento!

8 Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (1) Fisiologica è lattributo che si associa a numerose soluzioni saline. NaCl 0.9% = isotonica La soluzione fisiologica serve a mantenere un organo isolato in vita ed in condizioni stabili Manipolazione delle proprietà di una soluzione fisiologica

9 Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (2) La soluzione fisiologica deve: assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive O 2 37°C corretta composizione ionica pH osmolarità

10 Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e delle proteine (g/100 ml) nel plasma di alcune specie UomoRattoPorcellino dIndia Na K+K Cl Ca proteine

11 Ca 2+ Na + fenilefrina Ca 2+ IP 3 Ca 2+ Na + K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ Ca 2+ K+K+ Na +

12 Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e potenziali di equilibrio nel muscolo scheletrico di mammifero IoneConcentrazione extracellulare Concentrazione intracellulare [Ione] o /[Ione] i Potenziale di equilibrio Na K+K Ca x10 -7 M Cl RT [K + ] o Equazione di Nerst E K = ln nF [K + ] i

13 Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati Ringer anfibi KrebsTyrodeRinger Tyrode Locke De JalonReiter NaCl KCl MgSO NaH 2 PO KH 2 PO Glucosio NaHCO CaCl Gas aria95% O 2 5% CO 2 O 2 aria O2O2 95% O 2 5% CO 2 95% O 2 5% CO 2 proteine

14 Le concentrazioni plasmatiche degli ioni presentano specie-specificità SpecieIonizzatoTotale Cavia Ratto Uomo Concentrazioni (mM) di calcio ionizzato e totale nel plasma di alcune specie

15 pK a +1 pH fisiologico Sufficiente capacità tampone Le soluzioni fisiologiche sono soluzioni tampone La soluzione tampone: miscela tra un acido debole e la sua base coniugata minimizza le variazioni di pH Perché una coppia coniugata possa essere considerata come un tampone di rilevanza fisiologica:

16 Ca 2+ H 2 PO 4 + HPO 4 - pK a = 7.2 H 2 CO 3 + HCO 3 - pK a = 3.8 CO 2(acq.) CO 2(gas) Legge di Henry

17 Il pH Importante per la vitalità e funzionalità del tessuto Determina il grado di ionizzazione delle molecole AH BOH A - H + B + OH - Attività Inattività Enzimi Livelli di [Ca 2+ ] i Contrattilità muscolare Meccanismi osmotici Ecc.

18 Losmolarità Losmolarità di una soluzione deve essere vista come leffettiva pressione osmotica che questa soluzione può sviluppare sui tessuti. Una osmole = 22.4 atm a 0°C (pressione osmotica di una soluzione 1 M di un non- elettrolita ideale). Losmolarità di una soluzione reale può essere determinata direttamente dalla misura del punto di congelamento.

19 swelling Soluzione ipo-osmotica H2OH2O

20 shrinking Soluzione iper-osmotica H2OH2O

21 La temperatura Variabile fisiologica strettamente controllata nel vivente Influenza sia la risposta basale di un preparato che la responsività ai farmaci (utero di ratto) La riduzione della temperatura diminuisce il consumo di ossigeno ed il rischio di ipossia Influenza il pH delle soluzioni

22 Lossigenazione Importante per la sopravvivenza di un tessuto Apparato sperimentale, spessore del tessuto, consumo di ossigeno tessutale (temperatura e attività) e pressione parziale di ossigeno nella soluzione fisiologica influenzano lossigenazione. La quantità di un gas disciolto in soluzione dipende da: solubilità del gas nellacqua pressione del gas nella fase gassosa temperatura presenza di soluti nellacqua

23 I calcoli in laboratorio

24 Dalla molarità ai grammi (1) Come si esprime la concentrazione di una soluzione M = n / V con V = litro

25 Dalla molarità ai grammi (2) Come si calcolano i grammi da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti M = n / V con n = g / PM ne consegue che M = g / PM x V ovvero g = M x PM x V

26 La pesata approssimata Come si calcolano i g da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti di una sostanza costosa g = M x PM x V Preparare 1 ml di una soluzione di quercetina (PM = 338) 10 mM g = 0.01 x 338 x = pesata = g applico la proporzione g : 1 ml = g : X ml

27 La diluizione Come si prepara una soluzione a concentrazione e volume noti a partire da una soluzione più concentrata C 1 x V 1 = C 2 x V 2 1 indica la soluzione da preparare 2 indica la soluzione più concentrata C e V devono essere sempre espressi con la stessa unità di misura

28 Il problema solvente Molte sostanze impiegate nella ricerca di base e pre- clinica sono lipofile. dimetilsolfossido etanolo dimetilformammide metanolo

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