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PROGETTO BIOTECH 1 Regione Veneto – LINEA DI RICERCA N. 14 Inquinamento virale in acqua e loro sedimenti: lutilizzo della PCR nelle determinazioni analitiche.

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1 PROGETTO BIOTECH 1 Regione Veneto – LINEA DI RICERCA N. 14 Inquinamento virale in acqua e loro sedimenti: lutilizzo della PCR nelle determinazioni analitiche di adenovirus quale indice di qualità. EXPERTEAM

2 Experteam nasce nel 1996 per opera dei biologi Angelo De Bortoli e Federica Schiavon con una serie di kit innovativi in biologia molecolare per la ricerca di virus, batteri, protozoi e per la ricerca di malattie genetiche e tumori. ricerca produzione commercializzazione kit diagnostici ATTIVITA:

3 Diagnostica genetica (microdelezioni cromosoma Y in pazienti oligo e azoospermici, X fragile, fattori della coagulazione, emocromatosi) Diagnostica virale (HPV, CMV) Diagnostica batterica e parassitaria (m. tuberculosis e complex, b. burgdorferi, ch. pneumoniae, p. carinii, t. gondii, g. lamblia) Diagnostica oncologica (linfomi B e T, traslocazioni cromosomiche) Determinazione di microorganismi negli alimenti (salmonella e listeria) Diagnostica e monitoraggio ambientale Organizzazione e coordinamento corsi specialistici PRINCIPALI SETTORI DI ATTIVITA'

4 il rischio di contrarre patologie dalluso ricreativo delle acque analizzate (D.P.R. 155 del 1988: attuazione della direttiva 76/160/CEE relativa alla qualità delle acque di balneazione) gli indici di qualità delle acque sulla base dei microrganismi e virus presenti lefficienza di sistemi di depurazione un determinato ceppo batterico o virale definendone quindi anche lorigine (traceability). studio per la successiva produzione e messa in commercio di kit diagnostici basati su metodologie di biologia molecolare per la determinazione di virus, batteri e protozoi nelle acque costiere, lagunari, fluviali e di scarico al fine di determinare: SCOPO DEL PROGETTO

5 VIRUS ENTERICI PoliovirusEchovirusCoxsackievirus Rotavirus Reovirus Enterovirus Epatite ANorwalk virus Adenovirus virus escreti tramite le feci, caratterizzati dallabilità ad infettare principalmente i tessuti del tratto respiratorio e gastrointestinale delluomo e dei mammiferi

6 DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS NELLE ACQUE metodo tradizionale: coltura cellulare tecnicamente complesso lungo (10-30 gg. 1-3 passaggi BGM) costoso non sufficientemente sensibile nuove biotecnologie: RT-PCR tecnicamente semplice rapido poco costoso altamente sensibile e specifico

7 PRELIEVO CONCENTRAZIONE E DECONTAMINAZIONE I PASSAGGIO SU COLTURA CELLULARE EFFETTO CITOPATICO ASSENTE: Probabile assenza di virus enterici TECNICA DELL IMMUNO- FLUORESCENZA CAMPIONE POSITIVO: Presenza di enterovirus CAMPIONE NEGATIVO: Presenza di virus enterici e Assenza di enterovirus EFFETTO CITOPATICO PRESENTE: Presenza di virus enterici EFFETTO CITOPATICO ASSENTE: Probabile assenza di virus enterici TECNICA DELL IMMUNO- FLUORESCENZA CAMPIONE POSITIVO: Presenza di enterovirus CAMPIONE NEGATIVO: Presenza di virus enterici e Assenza di enterovirus EFFETTO CITOPATICO PRESENTE: Presenza di virus enterici EFFETTO CITOPATICO ASSENTE: TECNICA DELL IMMUNO- FLUORESCENZA CAMPIONE POSITIVO: Presenza di enterovirus CAMPIONE NEGATIVO: Presenza di virus enterici e Assenza di enterovirus II PASSAGGIO SU COLTURA CELLULARE III PASSAGGIO SU COLTURA CELLULARE CAMPIONE NEGATIVO: Assenza di virus enterici e di enterovirus METODO TRADIZIONALE Monostrato di cellule BGM (Buffalo Green Monkey). Sono cellule di rene di scimmia verde africana che hanno particolare suscettibilità per i virus enterici. Tale metodo richiede da un minimo di 10 ad un massimo di 30 giorni.

8 FASI DI MESSA A PUNTO DEL METODO FASI DI MESSA A PUNTO DEL METODO per la determinazione mediante PCR di enterovirus, adenovirus, HAV Ricerca bibliografica Ottimizzazione della procedura di estrazione di RNA e DNA Ottimizzazione della fase di retrotrascrizione-amplificazione (scelta primers, determinazione t. annealing, etc) Reperimento ed analisi di controlli positivi Campionamento ed analisi di campioni ambientali Confronto tra metodologie PCR e metodi tradizionali

9 RT-PCR per lanalisi di ENTEROVIRUS in campioni di acque di scarico alluscita dai depuratori protocollo singolo stepprotocollo PCR nested CN CP CN CP

10 protocollo singolo step protocollo PCR nested PCR per lanalisi di ADENOVIRUS in campioni di acque di scarico alluscita dai depuratori TIPIZZAZIONE ADENOVIRUS (sierotipi 40/41)

11 PROTOCOLLO OTTIMIZZATO prelievo campione concentrazione campione saggio su coltura cellulare (1 passaggio BGM) estrazione RNA virale retrotrascrizione PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio ENTEROVIRUS ADENOVIRUS prelievo campione concentrazione campione / estrazione DNA virale / PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio

12 CAMPIONI acqua superficiale EC ENTEROVIRUS (I° P BGM)ADENOVIRUS (TQ) IFPCR PCR 40/ POS 9552NEG POS 9554NEG POS 1397NEG POS 1398NEG 1728NEG POSNEG 2213NEG 2219NEG POSNEG 2389NEG POS 2558NEG 0485POS / 0321POS / acqua scarico 0706POS NEGPOSNEG 8970NEG POSNEG 9761NEG POS 2405NEG POS 2450NEG POS RISULTATI TOT. CAMPIONI 17 TOT. POSITIVI 3 ENTEROVIRUS TOT. POSITIVI 14 ADENOVIRUS

13 protocollo singolo step protocollo PCR nested CPCNB CPCN RT-PCR per lanalisi di HAV in campioni di acque di scarico alluscita dai depuratori RT-PCR per lanalisi di REOVIRUS in campioni di acque di scarico alluscita dai depuratori protocollo singolo step protocollo PCR nested CNCPB 123CN

14 PROTOCOLLO OTTIMIZZATO prelievo campione concentrazione campione estrazione RNA virale retrotrascrizione PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio HAV REOVIRUS prelievo campione concentrazione campione estrazione RNA virale retrotrascrizione PCR (I° ampl.) PCR nested (II° ampl.) elettroforesi gel agarosio

15 CAMPIONI ANALIZZATI POSITIVI ADENOVIRUS POSITIVI ENTEROVIRUS POSITIVI HAV 20 TQ12 (60%)1 (5%)0 (0%) 19 IP1 (5,3%)* 2 (10,5 %)*0 (0%) TOT (33,3%)3 (7,7%)0 (0%) *I campioni positivi agli enterovirus sono stati analizzati mediante PCR specifica per determinare se si trattava di poliovirus, coxsackie o echovirus, lanalisi ha escluso la presenza di poliovirus. Analisi di 39 campioni di acqua di scarico prelevati alluscita dei depuratori di 11 differenti siti nel periodo aprile –agosto 05.

16 CONCLUSIONI la ricerca di adenovirus, quali indicatori di inquinamento fecale, è più semplice e sensibile rispetto a quella di enterovirus, mentre la determinazione di HAV sembra non essere significativa dato che nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo a tale determinazione. maggiore sensibilità materiale genetico di partenza DNA non necessaria la coltura cellulare VANTAGGI RISCONTRATI NELLA RICERCA DI ADENOVIRUS RISPETTO ENTEROVIRUS E HAV:

17 MESSA A PUNTO DI METODICHE PER PCR QUANTITATIVA

18 Curve di amplificazione di 5 diluizioni (10 6,10 5,10 4,10 3,10 2 copie di genoma virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5 UTR di Enterovirus REAL TIME PCR metodica SYBR GREEN

19 Curve di amplificazione di 5 diluizioni (10 6,10 5,10 4,10 3,10 2,10 copie di genoma virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5 UTR di Enterovirus REAL TIME PCR metodica TAQ-MAN

20 Si sono determinati: 1)la quantità di carica virale presente mediante real time PCR 2)lo specifico ceppo (poliovirus, coxsackie o echovirus) mediante sequenziamento Lanalisi quantitativa effettuata mediante Real Time PCR metodica Sybr Green determinava una presenza di virus nei campioni concentrati 5000 volte pari a 0.2 e 0.3 UFP/ml (Unità Formanti Placca / ml). Lanalisi di sequenza ha necessitato la messa a punto di un nuovo protocollo in grado di amplificare regioni variabili tra i diversi ceppi di enterovirus. Le tre regioni analizzate e sequenziate sono state : 5NTR, VP1-2C, VP1-2. Analisi su due campioni dacqua concentrata già risultati positivi per la presenza di enterovirus con il kit Experteam Enterovirus kit 1

21 Sequenza ottenuta dallamplificato 5NTR del campione 1 Lanalisi in Gene Bank ha determinato Campione 1: Coxsackievirus B1 Campione 2: Pur non giungendo ad una specifica tipizzazione si è potuto escludere che si trattasse di un enterovirus di origine umana già descritto in letteratura.

22 Determinazione di adenovirus in campioni già risultati positivi mediante pcr qualitativa. Curve di amplificazione degli standard Analisi di campioni C T = 27 [500 copie/ l] C T = 34 [5 copie/ l] REAL TIME PCR metodica SYBR GREEN

23 Discussione Il confronto tra la determinazione mediante PCR qualitativa e Real Time PCR per la determinazione di enterovirus e adenovirus ha dimostrato come la PCR qualitativa risulti più sensibile rispetto alla Real Time. Daltra parte tutti i protocolli qualitativi utilizzati in questa fase erano nested mentre i protocolli Real Time erano tutti a singolo step. Un confronto tra la procedura quantitativa Taq-Man rispetto alla Sybr Green ha dimostrato una maggiore sensibilità per la Sybr Green. Ulteriori prove vanno però effettuate utilizzando maggiore quantità di acidi nucleici nella miscela di amplificazione.

24 DETERMINAZIONE DI ADENOVIRUS NEL CAMPIONE DI SEDIMENTO MEDIANTE NESTED PCR

25 INIBITORI DELLA PCR NEL SEDIMENTO Nellambito dellamplificazione di adenovirus per leliminazione delleffetto inbitore sono state provate 4 diverse procedure: 1.aggiunta di polivinilpolipirrolidone (PVPP) durante la procedura di estrazione 2.aggiunta di PVPP alla miscela di amplificazione 3.aggiunta della proteina di T4 gene Protein alla miscela di amplificazione 4.diluizione da 1/10 a 1/ del DNA estratto Campioni diluiti da 1:10 a 1:10000 Campioni con aggiunta della T4 Gene 32 Protein I risultati migliori si sono ottenuti con le procedure 3 e 4: laggiunta della T4 gene Protein permette di non diluire il DNA estratto la procedura di diluizione non necessita dellaggiunta di un ulteriore reagente. Non permette, però, di conoscere a priori il fattore di diluizione ideale per ogni campione

26 Lutilizzo dello strumento FastPrep Instrument (prodotto da Q-Biogene) ha reso notevolmente più semplice, sensibile e ripetibile lestrazione del DNA e del RNA da sedimento rispetto ad altri metodi finora utilizzati.

27 CONCLUSIONI ATTIVITA DI RICERCA (sett. 04 – dic. 05) Messa a punto di 6 kit in PCR qualitativa (enterovirus, poliovirus, adenovirus, adenovirus 40 e 41, HAV e reovirus) e 2 kit in PCR quantitativa (enterovirus e adenovirus) La determinazione mediante PCR di adenovirus risulta la migliore come indice di contaminazione ambientale in quanto più sensibile, rapida e semplice, sia in acque concentrate che nel sedimento, rispetto alla ricerca di altri virus o microrganismi Data la complessità delle matrici (acque concentrate e sedimenti) va posta particolare attenzione nella fase di estrazione degli acidi nucleici soprattutto per la presenza di inibitori della Taq-polimerasi I laboratori italiani che si occupano di monitoraggio ambientale hanno dimostrato forte interesse per lattività svolta, questo fa intuire un notevole successo di mercato dei prodotti e servizi sviluppati in tale ricerca.

28 Analisi delle acque di scarico, prelevati alluscita dei depuratori di 11 differenti siti già precedentemente analizzate, con laggiunta delle determinazioni di reovirus, norwalk virus e rotavirus. - campione negativo+ campione positivo/ campione non analizzato

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30 Lanalisi dei reovirus sono state effettuate sia sul campione TQ (campione di acqua sottoposto solamente al trattamento di decontaminazione e concentrazione) sia sul campione BGM (campione di acqua al quale è stato effettuato anche un passaggio di coltura cellulare su cellule BGM): nessun campione è risultato positivo. Lanalisi di norwalk e rotavirus è stata effettuata solamente sul campione TQ in quanto tali virus non crescono su una coltura di cellule BGM. SITO 3 Campione Data prelievo NORWALK Nested 6497TQ05/07/05? SITO 8 Campione Data prelievo NORWAL K Nested TQ02/08/05? SITO 7 Campione Data prelievo ROTAVIRU S Nested TQ27/04/05+ Lanalisi del sito 7 ha rilevato positività ai rotavirus, il dato è stato successivamente confermato mediante sequenziamento. Lanalisi dei siti 3 e 8 ha rilevato una probabile positività ai norwalk virus, il dato dovrà essere confermato mediante sequenziamento.

31 Norwalk virus Campione probabilmente positivo da verificare mediante sequenziamento 50°C 53°C 55°C 57°C 60°C 50°C 53°C 55°C 57°C 60°C 50°C 53°C 55°C 57°C 60°C Marcatore SITO SITO SITO Rotavirus 50°C 53°C 55°C 57°C 60°C 50°C 53°C 55°C marcatore SITO SITO Campione positivo, verificato con sequenziamentro

32 Sequenza dellamplificato di rotavirus

33 Analisi dei risultati ottenuti e confronto tra la positività riscontrate ai diversi virus analizzati, alla presenza di E. coli (determinazione effettuata per noi da ARPAV) ed al tipo di disinfezione presente nei diversi siti E.Coli (UFC/100ml) UFC: unità formanti colonia

34 NaClO ipoclorito di sodioCH 3 CO 3 H acido peracetico E.Coli (UFC/100ml)

35 I dati ottenuti hanno confermato ulteriormente come gli adenovirus risultino i migliori indicatori di contaminazione virale delle acque e che il trattamento di disinfezione migliore risulti quello con ipoclorito di sodio rispetto allutilizzo di acido peracetico o al trattamento con radiazioni UV. Interessante lanalisi del sito 4, dove ad unelevata presenza di E. coli si somma la positività allanalisi di enterovirus (unico sito positivo), la positivita ad adenovirus e lutilizzo di radiazioni UV come metodo di disinfezione.

36 Scelta dei siti di campionamento -Sito SA1: Mulino Stucky - Canale dei Lavraneri -Sito SA2: Rialto - Canal Grande -Sito SA3: Ospedale Fatebenefratelli - Rio di Zecchini -Sito SA4: Ospedale SS. Giovanni e Paolo - Fondamenta nuove -Sito SA5: Santa Marta - Rio delle Terese -Sito SA6: Ca Giustiniani - Rio delle Eremite -Sito SA7: Marghera - Canale Vittorio Emanuele -Sito SA8: Fusina - Naviglio del Brenta -Sito SA9: Marghera (zona industriale) - Canale dei Petroli -Sito SA10: Arsenale - Canale di San Pietro Siti SA3, SA4 e SA10 probabilmente positivi perchè situati nelle vicinanze di Ospedali Siti SA2, SA5 e SA6 probabilmente positivi perchè localizzati in canali nei quali vengono scaricate acque reflue Siti SA1 e SA7 probabilmente negativi perchè situati in aree con notevole ricambio dacqua Siti SA8 e SA9 presi in considerazione perchè vicini alla zona industriale di Marghera e Fusina Sono stati scelti 10 siti lagunari di campionamento, nei quali sono stati prelevati 10 litri dacqua e 100 gr di sedimento mediante una benna o un carotatore, in base alla possibile presenza o meno di virus Enterici

37 SA3 SA4 SA2 SA1 SA5 SA6 SA10

38 SA9 SA7 SA8

39 Carotatore utilizzato per i prelievi di sedimento Benna utilizzata per i prelievi di sedimento

40 I campioni di acqua prelevati da ogni sito (10 L) sono stati conservati a +4°C per un periodo massimo di due giorni. Sono stati sottoposti al trattamento di decontaminazione e concentrazione, quindi utilizzati per inoculare un monostrato di cellule BGM di coltura cellulare. Sono stati considerati positivi ai virus enterici i campioni che determinavano effetto citopatico dopo un unico passaggio su coltura cellulare (10 giorni). I campioni di sedimento prelevati da ogni sito (100 gr) sono stati conservati a -20°C per un periodo massimo di due giorni. E stata quindi effettuata lestrazione del DNA mediante il FastDNA® SPIN Kit for Soil e il FastPrep® Instrument (Qbiogene) e dellRNA mediante il FastRNA Pro Soil Direct Kit e il FastPrep® Instrument (Qbiogene). I campioni di DNA ed RNA estratti sono stati analizzati mediante i vari kit Experteam per la determinazione qualitativa dei diversi virus enterici.

41 Tabella risultati sedimento e acque Sito H 2 O effetto citopatico Sedimento Adenovirus Sedimento Enterovirus Sedimento HAV Sedimento Reovirus Sedimento Rotavirus Sedimento Norwalk virus SA SA SA3 +/ SA SA SA SA SA SA SA

42 Conclusioni relative ai dati sui sedimenti dellOspedale SS. Giovanni e Paolo. Le acque reflue dellOspedale vengono scaricate direttamente in acqua ed è probabile che contengano una maggiore quantità di virus, quindi è plausibile che questo sito sia maggiormente contaminato rispetto ad altri. E da chiarire, invece, la causa della positività del sito SA1. Il sito SA3 mostra una debole positività agli Enterovirus nel sedimento e un debole effetto citopatico nelle acque. Questo dato può indicare una correlazione tra presenza di virus nel sedimento e nellacqua circostante e può confermare lipotesi che il sedimento funga da serbatoio di virus presenti nellacqua. I siti SA2, SA6 ed SA10 sono positivi ai Rotavirus, probabilmente perché le acque reflue della zona sono scaricate direttamente in acqua e nei canali nei quali è stato effettuato il campionamento non vi è un grande ricircolo dacqua. Lacqua del sito SA8 ha una temperatura superiore alla media, data la presenza degli scarichi della centrale elettrica, e questo può spiegare la positività ai Rotavirus ma non ad altri virus enterici, dato che i Rotavirus sono riscontrati più frequentemente alle temperature più elevate. Il sito SA5 è risultato negativo per tutti i virus Enterici a RNA. I siti SA7 e SA9 sono risultati negativi a tutte le analisi per i virus Enterici a RNA probabilmente perché situati in una zona con grande ricircolo dacqua e nella quale non vi è scarico di acque reflue. I siti nei quali si riscontra una maggiore positività ai virus Enterici (Adenovirus, HAV e Rotavirus) sono i siti SA1 ed SA4. Il sito SA4 è situato nelle vicinanze

43 sario effettuare la medesima analisi mediante real time PCR (PCR quantitativa) al fine di individuare una possibile scala del livello di inquinamento. Particolarmente interessante in tale ambito risultano invece le determinazioni di HAV e rotavirus, in quanto i campioni di acqua analizzati precedentemente erano sempre risultati negativi a tali virus. Nessun campione analizzato è invece risultato positivo per lanalisi di norwalk virus e reovirus. Appare quindi evidente, anche se in via preliminare, come il significato dei diversi virus enterici rilevabili mediante PCR assuma valore diverso a seconda del tipo di campione analizzato (acqua o sedimento).I dati relativi al sedimento risultano comunque di difficile interpretazione non essendo ancora stata effettuata alcuna analisi in PCR sui campioni di acqua corrispondenti. Ulteriori informazioni si potranno ottenere dallanalisi mediante real time PCR di acqua e sedimento. Conclusioni Dallanalisi dei dati riportati in tabella risulta come la determinazione qualitativa di adenovirus nel sedimento risulti di poca rilevanza, dato che tutti i siti analizzati sono risultati positivi. Sarà quindi neces-

44 PROTOTIPI KIT ALLESTITI

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48 Adenovirus Kit 1 - RQ Sistema completo per la quantificazione di Adenovirus in campioni ambientali mediante Real Time PCR. La determinazione quantitativa oltre ad indicare un potenziale rischio sanitario, soprattutto per le categorie a rischio quali bambini, anziani, pazienti immunosoppressi, costituisce un indice di qualità dellacqua per il suo utilizzo in ambito potabile, ricreativo e lavorativo. Concentrazione PCR QUANTITATIVA Estrazione DNA Campioni dacqua Risultato : copie di genoma di Adenovirus presenti nel campione dacqua concentrato per l

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