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Valeria Losasso German Research School for Simulation Sciences GmbH Jülich, Germany.

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Presentazione sul tema: "Valeria Losasso German Research School for Simulation Sciences GmbH Jülich, Germany."— Transcript della presentazione:

1 Valeria Losasso German Research School for Simulation Sciences GmbH Jülich, Germany

2 Parkinsons disease (PD) Fatal neurodegenerative movement disorder, affecting an estimated four million people worldwide Loss of the neuromelanine expressing dopamine (DOP) neurons in the substantia nigra pars compacta Polymeropoulos MK et al., Science, (1997) Diagnostic features: Tremor Rigidity Akinesia and bradykinesia Postural instability

3 Deposition of Lewy bodies Spillantini MG et al., Nature, 1997 Major components: aggregates of alpha-synuclein ( -syn) protein Cookson MR, Annu, Rev. Biochem., 2005 Parkinsons disease (PD) N-terminalNAC C-terminal

4 Alpha synuclein Unstructured protein Uversky VN et al., Annu. Rev. Biophys, 2008 Soto C. et al., Nat, Rev. Neurosci., 2003 Partially folded intermediates

5 Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogsOverview Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants (Latawiec D. et al., PLoS ONE, 2010)

6 PD pathogenesis Soto C. et al., Nat, Rev. Neurosci., 2003 x x Bisaglia M. et al., J. Biol. Chem., 2007

7 Structural basis of the inhibition Herrera FE. et al., Plos ONE., 2008 Molecular dynamics (MD) simulations based on α- syns nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble: nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C- terminal; ( 125 YEMPS 129 region) long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83) Conway KA. et al., Science., 2001 Norris EH et al., J. Biol. Chem., 2005

8 Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structure/activity relationships Bostrom J et al., J. Med. Chem., 2006 Screening of ligands structurally and electrostatically similar to DOP Study of their binding to a-synuclein through MD simulations Aim of the work

9 NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE) Vendruscolo M., personal communication Dedmon MM et al., J. Am. Chem. Soc., Cluster analysis (Micheletti C. et al., Proteins, 2000) 6 representative structures Ligand.info database (von Grotthuss et al., Comb. Chem. High Throughput Screen., 2004) 60 molecules selected (10 for DOP and each derivative) Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T.. IBM Internal Report, 1957) 5 commercially available ligands Initial protein structures Ligand selectionMethods

10 6 representative structures Initial protein structures Ligand selectionMethods Docking 30 adducts with new ligands + 36 adducts with DOP and its oxidized products (Morris et al., J. Comp. Chem., 1998)

11 Standard MD setup: NAMD code Amber force field (parm99.dat) Resp parametrization of ligands Timestep 2 fs TIP3P water model with PBC NPT ensemble, 300 K (1 bar) SHAKE algorithm Particle Mesh Ewald (10 Å) Atoms: ~ Methods Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD) Experimental studies – in vitro fibrillization essays (G. Legname and S. Gustincich, SISSA/ISAS, Italy)

12 Results – Molecular Dynamics (Kcal/mol)

13 Results – Molecular Dynamics (Kcal/mol) Strongest effect on fibrillization? Test in vitro

14 Results – In vitro fibrillization essay

15 No fibrils, only spherical structures -syn only -syn + DOP hydroxyindole 4-(2- aminoethyl)aniline 6-aminoindole 2-amino-4-tertbutylphenol tyramine -syn only hydroxyindole 6-aminoindole mature fibrils >0.75 m intermediate fibrils m short fibrils (or protofibrils) <0.5 m Results – AFM analysis of aggregation

16 -syn alone: fibrils in cluster and longer than 0.75 m 6-aminoindole: individual stuctures, early stage of fibrillization 5-hydroxyindole: cluster of shorter fibrils Results – TEM analysis of aggregation

17 5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization Experimental tests: - Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases; - 6-aminoindole = strongest inhibitory effect - 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect - Morfology analysis by AFM different length and distribution - Ultra-structural analysis for 6-aminoindole: - fibrils more isolated - after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al., 2008) consistently with MD predictions Conclusions

18 Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogsOverview Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants (Latawiec D. et al., PLoS ONE, 2010)

19 Adapted from MacLean PJ et al., Neurosci. Lett., 2002 Known isoforms Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4Exon 5Exon 6 Mouse -syn Rat -syn 1 Rat -syn 2 Rat -syn 3 Human -syn 140 Human -syn 126 Human -syn 112 Human -syn 98 ATAT SNSN LMLM NGNG AYAY DN GS Polymeropoulos MH et al., Science, 1997

20 Alpha synuclein – isoform 2 Lab. Prof. S. Gustincich, SISSA 3 possible peptides syn N-term -syn C-term Empty Full-length Structural correlation with full- length alpha- synuclein?

21 Chirality index (G) Pietropaolo A. et al., Proteins, 2008 dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms Istantaneous values along MD trajectories Flexibility

22 Coil states have a chiral nature Pietropaolo A. et al., submitted Coil states: absence of correlation among consecutive and dihedrals Smith L. et al., Fold. Des., 1996 Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a random orientation

23 Computational procedure ATAT SNSN LMLM NGNG AYAY DN GS 6 mouse alpha-synuclein conformations MD 30 ns/conformation 180 ns

24 Results – Molecular dynamics (full-length) RMSDCluster analysis (10 Å cutoff) Chirality index and standard deviation

25 Results – Peptides G – 60 ns G – 120 ns G – 180 ns SD – 180 ns

26 Discussion carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full- length molecule (Murray A. et al., Biochemistry, 2003) Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production? homology with chaperon family (Beyer K., Acta Neuropathol. 2006) Regulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W. et al., Biochemistry, 2004) Binding to other proteins or cationic compounds Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility, having a protecting role

27 In progress: influence of mutations G – 180 ns Study of combined mutants: A53T + S87N L100M N103G A107Y D121G N122S

28 In progress: Fold factor Pietropaolo A. et al., submitted Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations Conditional probability All correlation maps

29 NGF-TrkA

30 Thanks Lab. Prof. Legname (SISSA) Lab. Prof. Gustincich (SISSA) A.Pietropaolo (UniCT) Prof. Carloni (GRS)

31 La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche, a partire da unisoforma di splicing alternativo, costituirebbe uneventualità molto interessante. Una delle modifiche post-traduzionali a cui lα- sinucleina è soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale, che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti allaggregazione ed alla fibrillazione *Murray et al. 2003]. Lo studio di questa modifica post-traduzionale si è sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina, quella rimanente al N-terminale, ma non si è mai indagato sul peptide generato dal taglio. Se questo peptide fosse prodotto in vivo, si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dallα-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore. In considerazione dellomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006], si può ipotizzare che questo peptide possa svolgere unattività simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici, in virtù del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al. 2004].Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro, un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa lattività funzionale del trascritto Δ2. Per poter effettuare questa valutazione, si è reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per lespressione in cellule eucariotiche, pcDNA 3.0. Allinterno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per lesone due, sia quella full length dellα-sinucleina, a partire dal primo esone distale.

32 Lanalisi per immunofluorescenzaLindagine per immunofluorescenza, oltre a consentire una valutazione qualitativa dellespressione proteica, è primariamente finalizzata alla stima dellefficienza di trasfezione, la quale risulta essere allincirca del 70%, con livelli comparabili tra le due forme di α- sinucleina.Per eseguire questa analisi, le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 1.6 μg di DNA. Al termine delle 24 ore, le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono, quindi, state incubate con due diversi anticorpi, i quali, pur essendo entrambi capaci di riconoscere lα-sinucleina, differiscono per la regione di legame. Dal momento che la forma Δ2 rappresenta lultima parte della proteina, un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 4.24) sarà in grado di riconoscere sia questo peptide, sia la forma FL. Se si impiega, invece, un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 4.24), solo lisoforma intera dellα-sinucleina potrà essere riconosciuta.Le immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo allisoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate.

33 Lanalisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato, si prosegue lindagine dellespressione proteica in vitro dellisoforma di splicing Δ2, mediante Western Blotting. Per questo studio, sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T, coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C- termEmptyΔ2FL103vuoto, di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate ed è stato raccolto lestratto proteico totale, con cui è stata effettuata lanalisi di Western Blotting.Per visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina è stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale. La differenza di peso molecolare risulta, infatti, sufficiente a discriminare tra le due, che pesano rispettivamente 17 kDa, la forma completa, e 4,6 kDa, la variante Δ2.Come si osserva in figura 4.25, solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale allaltezza corrispondente allisoforma di splicing. Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare, ad esempio utilizzando gel a gradiente, membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalità di blotting, nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse.

34 In considerazione dellomologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006], si può ipotizzare che questo peptide possa svolgere unattività simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici, in virtù del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al. 2004].

35 Questa seconda eventualità risulterebbe di grande interesse, perché potrebbe suggerire per questi peptidi unattività simile agli chaperoni, in considerazione dellalta omologia strutturale di questa regione dellα-sinucleina con la famiglia degli chaperoni. È stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dellα-sinucleina, dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina, mancanti proprio dellestremità C-terminale, maggiormente prone al processo fibrillogenico. Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione, si potrebbe immaginare che lespressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson, per lattenuazione del processo aggregativo dellα-sinucleina.

36 In particular, Alanine map [a] shows a high correlation, with a strong minimum centered at negative values, typical of α helix and in lower extent less positive values. Proline residue possesses a spread map [b], showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation. The map of methionine, recently reported to interplay protein–protein interactions20, shows an extra–diagonal peak at [+0.15, +0.03] values of chirality index, as inferred from Figure 2[c], which is absent in the cysteine map of Figure 2[d].

37 Once all the correlation maps of native chirality are obtained, we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures, as expressed in the following:kT NGdataset Fold factor = NG i=1 logP(Gi+1,Gi,AA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone, dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 0.6 Kcal/mol at 300 K. P(Gi+1,Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i, with Gi+1 and Gi values, in the correlation maps of native chirality. Since we are summing energy quantity, the probability taken into account are not conditional, like those reported in Figure 2 [a]-[d], but normalized as conventional joint probability.

38 Random structures of lysozyme, instead, show high values, whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi, Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values. Supporting its effectiveness, the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor, comparable to that one of SCOP classes. Moreover, an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma- subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies, in accordance with the recent contribution of Liu et al.21. The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme, which indicates a dynamical but not random conformational ensemble.


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