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Considerazioni sulla creazione di cibridi-stemibridi-chimere.

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Presentazione sul tema: "Considerazioni sulla creazione di cibridi-stemibridi-chimere."— Transcript della presentazione:

1 Considerazioni sulla creazione di cibridi-stemibridi-chimere

2 zigote cocs co fecondazione cariogamia spermatozoo cs Spermatozoo con nucleo e cromosomi cs Cellula uovo co Cellula uovo con nucleo e cromosomi co, mitocondri co-cs

3 zigote Spermatozoo con nucleo e cromosomi cs Cellula uovo con nucleo e cromosomi co, mitocondri co-cs Lo zigote possiede informazioni per lo sviluppo del nuovo individuo contenute nei cromosomi di origine materna e paterna: co-cs il patrimonio citoplasmatico in particolare i mitocondri, sono solo di origine materna Mitocondri con proprio DNA I mitocondri sono sede delle reazioni che forniscono energia alla cellula La loro moltiplicazione, attività, dipendono da un equilibrato, corretto, rapporto con le informazioni che li riguardano, provenienti dal DNA nucleare

4 Nucleo con proprio DNA, nucleare co-cs Mitocondri con proprio DNA, mitocondriale Per uno sviluppo normale dellindividuo, è necessario che il meccanismo enzimatico di accoppiamento tra le reazioni dipendenti dal genoma nucleare e il genoma mitocondriale siano perfettamente sintonizzate Si sta cercando di comprendere la natura di tale meccanismo anche creando degli ibridi cellulari con genoma nucleare e genoma mitocondriale appartenenti a specie diverse o uguali (ibridi interspecifici e intraspecifici) Zigote normaleZigote con nDNA e mDNA interspecifici Zigote con nDNA e mDNA intraspecifici donna1 donna2 capra pecora

5 Il numero di mitocondri presenti inizialmente (1000…) va riducendosi nelle cellule embrionali (5-10…) e poi mediante moltiplicazione vanno aumentando durante le fasi della differenziazione cellulare, istogenesi,organogenesi. Sono indispensabili per la vita della cellula La trascrizione e replicazione del mDNA sono guidate da fattori mitocondriali, codificati e prodotti dal nDNA, e trasferiti nei mitocondri ove interagiscono con sequenze presenti nel mDNA non codificante nDNA mDNA La replicazione del mDNA cessa poco prima della fecondazione e riprende allo stadio di blastocisti matura (nelluomo: circa 2 miliardi al secondo ! > durata media 100 giorni)

6 cibrido ibrido citoplasmatico, ottenuto inserendo un nucleo(diploide) di cellula somatica in una cellula (denucleata) della stessa specie (cibrido intraspecifico) o di specie diversa (cibrido interspecifico) denucleazione Inserimento nucleo Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2 il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nellovocita ricevente, al quale è stato asportato il nucleo:lo zigote possiede il DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente: ibrido omoplastico Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri Oocita ricevente, aploide, con propri mitocondri

7 denucleazione Inserimento nucleo e fusione citoplasmi Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2 il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nellovocita ricevente, al quale è stato asportato il nucleo: vengono anche fusi i due citoplasmilo zigote possiede il DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente e della donatrice:ibrido eteroplasmatico Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri Oocita ricevente, aploide, con propri mitocondri

8 stembrido ibrido citoplasmatico, ottenuto inserendo un nucleo(diploide) di cellula somatica in una cellula staminale embrionale (denucleata) della stessa specie (stemibrido intraspecifico) o di specie diversa (stemibrido interspecifico) denucleazione Inserimento nucleo in cellule staminali embrionali esistenti Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2 il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nella staminale ricevente, alla quale è stato asportato il nucleo:la nuova cellula possiede il DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri Cellule staminali embrionali riceventi, diploidi, con propri mitocondri

9 Chimera: embrione ottenuto disaggregando stadi embrionali precoci nei singoli blastomeri e successivamente riaggregando i blastomeri di specie diversa in percentuali variabili, allo scopo di studiare la biologia dello sviluppo e la funzione specifica di determinati geni nella genesi di particolari malattie blastomeri1 blastomeri2Aggregazione blastomeri blastocisti Impianto in utero madre adottiva chimere

10 In genere si può affermare che il numero di gravidanze a termine e di nati vivi, nel caso di cibridi interspecifici, si verifica solo allinterno dello stesso genere (tra bovini, tra ovini, tra equidi, tra felini) Negli altri cibridi di diverso genere, si arriva al massino allo stadio di blastocisiti: es.mucca+cavallo, coniglio+macaco > blastocisiti es.mucca+balena, maiale+coniglio << blastocisiti Probabile cibrido ottenuto inserendo nucleo di linfocita umano in oocita denucleato di bovino > linea staminale embrionale umana Inserimento di nuclei di cellule somatiche umane, di vario tipo, in oociti denucleati di anfibio( rana, xenopus) > riprogrammazione e riattivazione del gene OCT-4 indicatore della potenzialità staminale richiamata nel nucleo somatico differenziato Importante riuscire a comprendere il meccamismo biochimico presente nel citoplasma degli ovociti, capace di riprogrammare il DNA nucleare delle cellule somatiche, differenziate Sembra ormai certo che la riattivazione del sistema mitocondriale dipende dal corretto trasferimento degli elettroni della catena respiratoria e questo in funzione di 13 proteine, 2 rRNA, 22 RNA mitocondriali e 67 prodotti codificafi nel DNA nucleare

11 Lo sviluppo embrionale risulta controllato inizialmente solo dal corredo citoplasmatico ovulare (materno) mediante RNA messaggeri prodotti dalloocita: il genoma dello zigote si attiva solo allo stadio di 2 blastomeri (topo), 4 blastomeri (uomo), 8 blastomeri (bovini, caprini). Cibrido : nucleo somatico umano > oocita animale a blastocisti avanzata, predominano prodotti genici umani, essendo stati ormai degradati quelli animali presenti nelloocita ricevente, eccetto poche eventuali proteine Importanza delle ricerche su ibridi interspecfici e intraspecifici a livello umano Ottenere linee di cellule staminali riprogrammando cellule somatiche come se fossero staminali embrionali, senza ricorrere agli ovociti Cercare di comprendere il meccanismo che nel citoplasma degli ovociti permette di risvegliare il DNA differenziato e riportarlo allo stato di totipotenza come se fosse una cellula embrionale totipotente

12 cellule staminali pluripotenti indotte, iPS : cellule somatiche adulte riprogrammate alla pluripotenza staminale Cellule iPS murine e umane sono state ottenute da cellule somatiche differenziate adulte, indotte a esprimere combinazioni di geni tipici di stadio staminale, implicati nella promozione o mantenimento della pluripotenza (es.fattori di trascrizione OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, Nanog, Lin28). Cellula somatica umana differenziata Cellula somatica di topo differenziata Cellule somatiche riprogrammate >staminali

13 Le cellule, per es. fibroblasti della pelle, vengono riprogrammate e acquistano una pluripotenzialità staminale, con la capacità di generare tutti i tipi di cellule differenziate, sia somatiche sia germinali. Cellule iPS sono state successivamente ottenute da cellule staminali neurali adulte murine e umane, mediante lespressione del solo fattore OCT4. Fibroblasto, differenziato > fibroblasti Fibroblasto riprogrammato Cellula nervosa Cellula ematica Cellula germinale

14 Lo sviluppo di cellule iPS rappresenta un significativo avanzamento non solo verso la comprensione della regolazione epigenetica della trascrizione, per riprogrammare il destino cellulare nelle cellule somatiche terminalmente differenziate, ma anche verso la possibilità di generare cellule staminali pluripotenti individualizzate, a partire da cellule somatiche adulte, per trapianti terapeutici in vivo: senza dover ricorrere alle cellule staminali di embrioni ottenuti solo allo scopo di ottenere linee staminali da utilizzare per le varie ricerche e terapie a diversi livelli (problemi etici..)

15 Es.di applicazione del trasferimento di nucleo di cellula somatica di donna1 in ovocita di donna2, per aggirare il pericolo derivante da mitocondri anomali della donna1 che desidera avere un figlio Asportazione del nucleo dellovocita di donna2 Inserimento del nucleo diploide di cellula somatica di donna1 Mitocondri alteratiMitocondri normali Fecondazione in vitro con spermatozoo zigote Zigote: geneticamente possiede corredo di donna1, mitocondri di donna2 ma con DNA senza influenza sulle caratteristiche dellindividuo

16 Cenni su alcune caratteristiche delluovo

17 Uovo : bioreattore capace di riprogrammare geneticamente il genoma di cellule differenziate Animali transgenizzati possono produrre uova contenenti nellalbume molecole facilmente separabili e utilizzabili in terapie varie: interferone umano, anticorpo monoclonale murino umanizzato contro il melanomamaligno.. Possibile iniettare RNA messaggero di coniglio in uova di xenopus (rana) per ottenere emoglobina di coniglio Crioconservazione di spermatozoi e uova per problemi di fecondazione assistita, utilizzazione futura per eventuali fecondazioni in casi di sterilità o trattamenti che pregiudicano la fertilità ecc. Ricerche per riottenere la oogenesi in ovari non più ovulanti

18 Le uova presentano grande varietà di dimensioni (struzzo…mammiferi) uova umane circa 200 micrometri Uovo di gallina:citoplasma (tuorlo) suddiviso in citoplasma formativo + nucleo: polo animale: ricco di mitocondri, ribosomi, RNAm contribuisce alla formazione dellembrione nutritivo (vitello, lecite):polo vegetativo: lipidi,proteine:glicogeno: contribuisce al nutrimento dellembrione guscio:costituito da proteine, fosfato di calcio, carbonato di calcio e magnesio(albume:barriera protettiva, riserva di proteine,vitamine,H2O) (guscio e albume forniti alla cellula uovo mentre attraversa lovidutto) In funzione della quantità e distribuzione del lecite si distiguono uova: telolecitiche (ricche di lecite…monotremi, gasteropodi, uccelli, rettili, anfibi, pesci) oligolecitiche (povere di lecite..placentati, echinodermi) mesolecitiche(poco lecite..anuri) La distribuzione omogenea del citoplasma formativo porta alla formazione di zigoti con blastomeri dotati di tutte le informazioni necessarie per sviluppare un nuovo individuo(se vengono separate):uova regolatrici la distribuzione ineguale genera zigoti a mosaico, con blastomeri dotati solo di parte del corredo genetico:uova a mosaico Fonte energetica importante:Ricco di proteine ad elevato potere nutritivo, vitamine, fosfolipidi, minerali Potere calorico basso 65 calorie/uovo gallina

19 Oogenesi umana: due ovari rivestiti d tonaca albuginea (connettivo) con zona corticale (presenta oociti in vario stadio di maturazione) zona midollare (presenta connettivo e vasi sanguigni) Gli oogoni si moltiplicano per mitosi e si differenziano per meiosi durante il periodo embrionale e parte di quello fetale:alla nascita sono presenti vari tipi maturativi:la meiosi definitiva riprenderà, ciclicamente, alla pubertà e continuerà fino alla menopausa ( circa 500 in circa 30 anni) La meiosi comporta una doppia divisione con comparsa di una cellula uovo (gamete) e 3 polociti o globuli polari: se avviene la fecondazione si forma lo zigote che possiede il corredo cromosomico diploide tipico della specie (46 cromosomi nelluomo); se non avviene la fecondazione luovo è destinato alla morte. Nella partenogenesi si può ottenere uno zigote, diploide, mediante lassorbimento da parte delluovo, di un globulo polare:può essere accidentale, facoltativa(api), ciclica(rotiferi) telitoca > solo femmine:afidi, rotiferi arrenotoca > solo maschi:api deuterotoca > maschi e femmine


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